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Genetic and functional analysis of the PDB6 locus in Paget's disease of bone
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|---|---|---|---|---|
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Paget’s disease of bone (PDB) is the most frequent metabolic bone disease after
osteoporosis, and despite having a strong genetic component, Sequestosome 1 is the
only gene directly linked, so far, to this disease. Genome wide linkage and association
studies have suggested an association of PDB6 locus with PDB, however no
functional studies were performed to try to explain that association. The main goal of
this work was to assess the relative contribution of each significant variant identified
in the PDB6 locus to the functionality of the candidate genes and their involvement in
PDB pathophysiology. In this regard we analyzed the entire PDB6 locus to search for
the best candidate genes likely to be involved in bone metabolism. OPTN, CCDC3,
UCMA/GRP, CAMK1D, PHYH and SEPHS1 were selected and screened for genetic
variants. Together with the variants found in a previous work from our group (Michou
et al 2012) we studied 82 genetic variants, from which we selected rs2234968 and
rs3829923 for an association study. The results showed that only rs2234968 was
significantly associated with PDB (p-value = 6 x 10-3). In addition, we assessed the
effect of a rare variant (RV) found in one PDB patient, RV -9906, and rs1561570, a
SNP in OPTN strongly associated with PDB. Our functional studies showed that (i)
rs3829923 was responsible for an increase of OPTN promoter activity due to the
appearance of new binding sites for activator nuclear factors E47 and E2F1, while (ii)
RV -9906 was responsible for an increase of OPTN promoter activity but due to the
loss of SP1 binding and consequent loss of its inhibitory effect in gene transcription.
Rs2234968 was found to be in linkage disequilibrium with two SNPs that changed
OPTN splicing, thus creating a premature stop codon, and probably resulting in a nonfunctional
protein. In this work we showed that rs1561570, the SNP most associated
to PDB, was responsible for the loss of a methylation site that subsequent increase in
OPTN expression, which in turn increases NF-κB translocation into the nucleus and
activation of NF-κB target genes. This will explain the increase in number and
activity of the osteoclasts of PDB patients carrying of the rs1561570. In this work we
provide new insights about OPTN regulation and its role in bone metabolism, with
emphasis in osteoclastogenesis, and more importantly the contribution of OPTN
variants to PDB pathophysiology.
A doença óssea de Paget (DOP) é a doença óssea metabólica mais frequente a seguir à osteoporose, afectando 3% da população Caucasiana a partir dos 55 anos. Esta doença é caracterizada por um aumento focal e desorganizado do metabolismo ósseo devido ao aumento do número, tamanho e atividade dos osteoclastos, as células responsáveis pela reabsorção óssea. No entanto, posteriormente existe também um aumento no número e atividade dos osteoblastos que, na tentativa de recuperar o osso que foi reabsorvido, dão origem a um osso que não possui uma estrutura normal, tem fraca qualidade e é mais susceptível de sofrer deformações e fraturas. Este tecido ósseo desorganizado é caracterizado por apresentar hipertrofia, fragilidade e hipervascularização, podendo diminuir drasticamente a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, a maioria dos casos são assintomáticos. A sua prevalência aumenta com a idade e é mais frequente em países da Europa, como a Inglaterra. As causas da DOP ainda não foram clarificadas. Pensa-se que possa ter uma componente ambiental e que a exposição a agentes como o fumo do tabaco ou arsénio, ou a factores relacionados com uma vida rural como o consumo de leite não pasteurizado e o contacto com animais de quinta, pode contribuir para um aumento da susceptibilidade para desenvolver DOP. A existência de uma infeção viral pelo vírus do sarampo também foi considerada um forte factor de risco, mas essa relação continua ainda por comprovar. A DOP possui também uma componente genética, com um padrão de hereditariedade autossómico dominante com penetrância incompleta, que vai desde os 17% antes dos 50 anos de idade até aos 80% depois dos 60 anos de idade. Cerca de 15 a 40% dos pacientes apresentam uma história familiar positiva, no entanto pensa-se que este número será muito maior devido ao facto desta ser uma patologia assintomática. O único gene associado à DOP até ao momento é o Sequestosoma 1 (SQSTM1/p62), que codifica para a proteína p62 que, por sua vez, está envolvida na iniciação da via do NF-κB, regulando a ubiquitinação da TRAF6 e a consequente degradação do inibidor do NF-κB (IκB), o que resulta na libertação do NF-κB para o núcleo. No entanto mais de 60% dos pacientes não têm qualquer mutação no SQSTM1, o que sugere que outros genes estarão envolvidos na DOP. Em 2010 estudos de ligação e de associação sugeriram que existia uma relação entre o locus PDB6, nomeadamente o polimorfismo rs1561570 localizado no gene da Optineurina (OPTN), e a DOP, mas não existem estudos funcionais que expliquem esta relação. Assim, o objectivo principal deste trabalho foi analisar o locus PDB6 e tentar explicar a contribuição das variações genéticas encontradas para a DOP. Para isso analisámos toda a região do locus PDB6 e procurámos genes que pudessem ter um papel no metabolismo ósseo. Assim, selecionámos os genes OPTN, CCDC3, UCMA/GRP, CAMK1D, PHYH e SEPHS1 que foram sequenciados utilizando uma amostra de 30 casos familiares e 5 controlos saudáveis. Juntamente com um trabalho anterior elaborado pelo nosso grupo foram encontradas no total 82 variantes genéticas nos seis genes analisados. Destas, duas foram selecionadas devido à sua frequência no grupo de pacientes e devido à sua localização genómica – o rs2234968 (G>A), localizado no primeiro exão codante da OPTN, e o rs3829923 (C>T), localizado no promotor partilhado entre os genes OPTN e CCDC3. Posteriormente, foi feito um estudo de associação com 225 pacientes e 298 controlos saudáveis que mostrou existir uma associação à DOP estatisticamente significativa (p-value = 6 x 10-3) unicamente para o polimorfismo rs2234968. Os estudos funcionais foram feitos com o objectivo de explicar o efeito (i) do polimorfismo rs1561570 - posteriormente associado à DOP -, (ii) do polimorfismo rs2234968 - descrito como associado à DOP neste trabalho -, e (iii) de duas variantes localizadas no promotor da OPTN, o polimorfismo rs3829923 - encontrada neste trabalho - e a variante rara RV -9906 - encontrada num único paciente, num trabalho anterior do nosso grupo. Os resultados obtidos mostraram que o polimorfismo rs3829923 era responsável por um aumento da atividade basal do promotor da OPTN devido à criação de um novo local de ligação dos factores de transcrição E47 e E2F1. Também foi demonstrado que a variante rara RV -9906 é responsável por um aumento da atividade do promotor da OPTN, mas neste caso devido à perda de ligação e consequente efeito inibitório do factor de transcrição SP1. Em relação ao polimorfismo rs2234968, os resultados mostram que este se encontra em desequilíbrio de ligação com outros dois polimorfismos - o rs10906303 e o rs79529484 - que são responsáveis por uma alteração no padrão de splicing da OPTN, alterando o quadro de leitura e originando um codão stop prematuro. A proteína resultante perde a maioria dos seus domínios proteicos e por isso é provável que seja degradada. Em relação ao polimorfismo rs1561570 (C>T), através do tratamento do DNA de pacientes e controlos saudáveis com bissulfito, e de técnicas como o qPCR ou western blot, verificámos que o alelo mais comum nos pacientes - o alelo T - era responsável pela perda de um local de metilação e pelo aumento da expressão de OPTN. Também foi possível verificar que a presença do alelo T aumenta a translocação do NF-κB para o núcleo e a expressão dos seus genes alvo envolvidos na osteoclastogénese (tal como o NFATc1). Além disso a presença do alelo T também está relacionada com um aumento da taxa de diferenciação de osteoclastos, assim como um aumento no número de núcleos e na atividade destes osteoclastos, explicando assim o fenótipo pagético. Por fim, foi feita uma análise bioinformática em que se comparou a conservação, ao longo da evolução, dos genes mais relevantes para a DOP - o SQSTM1 e a OPTN -, nomeadamente entre o humano e o peixe-zebra. Através deste estudo verificou-se que ambos os genes são conservados entre humano e peixe-zebra e que aparentam possuir mecanismos de regulação semelhantes, com base na presença de locais putativos de ligação de factores de transcrição em comum nas duas espécies. É de destacar a conservação do resíduo P392 no SQSTM1 (frequentemente mutado em pacientes com DOP) nas duas espécies, o que mostra que o peixe-zebra poderá ser um bom modelo para estudar o efeito desta mutação no metabolismo ósseo. Em relação ao gene da OPTN é de realçar o facto deste gene ser expresso nos mesmos tecidos nas duas espécies, entre eles o tecido ósseo, o que indicia que o papel da OPTN possa ser semelhante nestas duas espécies. Este trabalho permite concluir que o locus PDB6 é relevante no estudo da DOP, dado que possui vários genes com um possível papel no osso, nomeadamente o gene da OPTN. Foi possível decifrar novos mecanismos de regulação do gene OPTN desconhecidos até à data e propor um mecanismo que relacione este gene com a osteoclastogénese e com a DOP.
A doença óssea de Paget (DOP) é a doença óssea metabólica mais frequente a seguir à osteoporose, afectando 3% da população Caucasiana a partir dos 55 anos. Esta doença é caracterizada por um aumento focal e desorganizado do metabolismo ósseo devido ao aumento do número, tamanho e atividade dos osteoclastos, as células responsáveis pela reabsorção óssea. No entanto, posteriormente existe também um aumento no número e atividade dos osteoblastos que, na tentativa de recuperar o osso que foi reabsorvido, dão origem a um osso que não possui uma estrutura normal, tem fraca qualidade e é mais susceptível de sofrer deformações e fraturas. Este tecido ósseo desorganizado é caracterizado por apresentar hipertrofia, fragilidade e hipervascularização, podendo diminuir drasticamente a qualidade de vida dos pacientes. No entanto, a maioria dos casos são assintomáticos. A sua prevalência aumenta com a idade e é mais frequente em países da Europa, como a Inglaterra. As causas da DOP ainda não foram clarificadas. Pensa-se que possa ter uma componente ambiental e que a exposição a agentes como o fumo do tabaco ou arsénio, ou a factores relacionados com uma vida rural como o consumo de leite não pasteurizado e o contacto com animais de quinta, pode contribuir para um aumento da susceptibilidade para desenvolver DOP. A existência de uma infeção viral pelo vírus do sarampo também foi considerada um forte factor de risco, mas essa relação continua ainda por comprovar. A DOP possui também uma componente genética, com um padrão de hereditariedade autossómico dominante com penetrância incompleta, que vai desde os 17% antes dos 50 anos de idade até aos 80% depois dos 60 anos de idade. Cerca de 15 a 40% dos pacientes apresentam uma história familiar positiva, no entanto pensa-se que este número será muito maior devido ao facto desta ser uma patologia assintomática. O único gene associado à DOP até ao momento é o Sequestosoma 1 (SQSTM1/p62), que codifica para a proteína p62 que, por sua vez, está envolvida na iniciação da via do NF-κB, regulando a ubiquitinação da TRAF6 e a consequente degradação do inibidor do NF-κB (IκB), o que resulta na libertação do NF-κB para o núcleo. No entanto mais de 60% dos pacientes não têm qualquer mutação no SQSTM1, o que sugere que outros genes estarão envolvidos na DOP. Em 2010 estudos de ligação e de associação sugeriram que existia uma relação entre o locus PDB6, nomeadamente o polimorfismo rs1561570 localizado no gene da Optineurina (OPTN), e a DOP, mas não existem estudos funcionais que expliquem esta relação. Assim, o objectivo principal deste trabalho foi analisar o locus PDB6 e tentar explicar a contribuição das variações genéticas encontradas para a DOP. Para isso analisámos toda a região do locus PDB6 e procurámos genes que pudessem ter um papel no metabolismo ósseo. Assim, selecionámos os genes OPTN, CCDC3, UCMA/GRP, CAMK1D, PHYH e SEPHS1 que foram sequenciados utilizando uma amostra de 30 casos familiares e 5 controlos saudáveis. Juntamente com um trabalho anterior elaborado pelo nosso grupo foram encontradas no total 82 variantes genéticas nos seis genes analisados. Destas, duas foram selecionadas devido à sua frequência no grupo de pacientes e devido à sua localização genómica – o rs2234968 (G>A), localizado no primeiro exão codante da OPTN, e o rs3829923 (C>T), localizado no promotor partilhado entre os genes OPTN e CCDC3. Posteriormente, foi feito um estudo de associação com 225 pacientes e 298 controlos saudáveis que mostrou existir uma associação à DOP estatisticamente significativa (p-value = 6 x 10-3) unicamente para o polimorfismo rs2234968. Os estudos funcionais foram feitos com o objectivo de explicar o efeito (i) do polimorfismo rs1561570 - posteriormente associado à DOP -, (ii) do polimorfismo rs2234968 - descrito como associado à DOP neste trabalho -, e (iii) de duas variantes localizadas no promotor da OPTN, o polimorfismo rs3829923 - encontrada neste trabalho - e a variante rara RV -9906 - encontrada num único paciente, num trabalho anterior do nosso grupo. Os resultados obtidos mostraram que o polimorfismo rs3829923 era responsável por um aumento da atividade basal do promotor da OPTN devido à criação de um novo local de ligação dos factores de transcrição E47 e E2F1. Também foi demonstrado que a variante rara RV -9906 é responsável por um aumento da atividade do promotor da OPTN, mas neste caso devido à perda de ligação e consequente efeito inibitório do factor de transcrição SP1. Em relação ao polimorfismo rs2234968, os resultados mostram que este se encontra em desequilíbrio de ligação com outros dois polimorfismos - o rs10906303 e o rs79529484 - que são responsáveis por uma alteração no padrão de splicing da OPTN, alterando o quadro de leitura e originando um codão stop prematuro. A proteína resultante perde a maioria dos seus domínios proteicos e por isso é provável que seja degradada. Em relação ao polimorfismo rs1561570 (C>T), através do tratamento do DNA de pacientes e controlos saudáveis com bissulfito, e de técnicas como o qPCR ou western blot, verificámos que o alelo mais comum nos pacientes - o alelo T - era responsável pela perda de um local de metilação e pelo aumento da expressão de OPTN. Também foi possível verificar que a presença do alelo T aumenta a translocação do NF-κB para o núcleo e a expressão dos seus genes alvo envolvidos na osteoclastogénese (tal como o NFATc1). Além disso a presença do alelo T também está relacionada com um aumento da taxa de diferenciação de osteoclastos, assim como um aumento no número de núcleos e na atividade destes osteoclastos, explicando assim o fenótipo pagético. Por fim, foi feita uma análise bioinformática em que se comparou a conservação, ao longo da evolução, dos genes mais relevantes para a DOP - o SQSTM1 e a OPTN -, nomeadamente entre o humano e o peixe-zebra. Através deste estudo verificou-se que ambos os genes são conservados entre humano e peixe-zebra e que aparentam possuir mecanismos de regulação semelhantes, com base na presença de locais putativos de ligação de factores de transcrição em comum nas duas espécies. É de destacar a conservação do resíduo P392 no SQSTM1 (frequentemente mutado em pacientes com DOP) nas duas espécies, o que mostra que o peixe-zebra poderá ser um bom modelo para estudar o efeito desta mutação no metabolismo ósseo. Em relação ao gene da OPTN é de realçar o facto deste gene ser expresso nos mesmos tecidos nas duas espécies, entre eles o tecido ósseo, o que indicia que o papel da OPTN possa ser semelhante nestas duas espécies. Este trabalho permite concluir que o locus PDB6 é relevante no estudo da DOP, dado que possui vários genes com um possível papel no osso, nomeadamente o gene da OPTN. Foi possível decifrar novos mecanismos de regulação do gene OPTN desconhecidos até à data e propor um mecanismo que relacione este gene com a osteoclastogénese e com a DOP.
Description
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015
Keywords
Ciências biomédicas Doenças dos ossos Peixe zebra Polimorfismo