Study of anterior structures formation in Xenopus laevis: insights on the role of novel gene XADTK2 in Xenopus embryogenesis

Burlacu, Marta Isabel Martins Vitorino

http://hdl.handle.net/10400.1/444

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Authors

Burlacu, Marta Isabel Martins Vitorino

Advisor(s)

Belo, José António

Abstract(s)

As experiências efectuadas no inicio do século passado por Spemann e Mangold demonstraram que o lábio dorsal do blastoporo de embriões de anfíbio consegue induzir as células vizinhas a mudar o seu destino e a formar um embrião secundário completo. Neste embrião, a notocorda e a placa basal do tubo neural são provenientes do tecido transplantado, mas o tubo neural, os pronéferos, a maior parte dos sómitos e o sistema digestivo são provenientes do embrião hospedeiro. Spemann demonstrou ainda que as características indutoras do organizador (o lábio dorsal do blastoporo) vão sendo alteradas ao longo do tempo. Enquanto que, se o lábio dorsal do blastoporo for transplantado para a zona ventral de outro embrião no inicio da gástrula vai induzir a formação de um eixo secundário completo, se este for transplantado na fase final de gástrula para a zona ventral de um embrião hospedeiro, apenas consegue induzir a formação de estruturas do tronco e da cauda. Esta experiência levou ao aparecimento do conceito de que, nos anfíbios, o organizador de Spemann é subdividido em duas regiões, o organizador da cabeça e o organizador do tronco/cauda. A caracterização das moléculas expressas no organizador de Spemann tem demonstrados a existência de moléculas com diferentes capacidades de indução, as que induzem estruturas da cabeça como Cerberus, Dickkopf-1 e Frizzled, e as que induzem estruturas mais posteriores de tronco e cauda, tais como Chordin e Noggin. Em Xenopus laevis foi observado que os genes indutores da cabeça como é o caso de cerberus, são expressos em gástrula na região mais interna da mesendoderme anterior não evolutiva. Em ratinho estes genes são expressos na AVE (Endoderme visceral anterior) a estrutura topologicamente equivalente à ADE (Endoderme dorsal anterior) de Xenopus. Vários estudos realizados em ratinho mostraram que nesta zona eram expressos vários genes necessários para a formação de estruturas anteriores, nomeadamente da cabeça e do sistema nervoso central. Com base nestes estudos foi proposto que a AVE de ratinho e as estruturas topologicamente equivalentes de outros vertebrados fossem consideradas o centro organizador da cabeça. Com base nestes pressupostos e com o intuito de melhor conhecer os genes e mecanismos envolvidos na indução de estruturas anteriores do embrião foi efectuado anteriormente no nosso laboratório um rastreio de genes diferenciadamente expressos na AVE de ratinho. Deste estudo descobriram-se muitos genes novos com expressão aumentada nesta zona do embrião, entre eles, o Shisa e o ADTK1. Resumo vii Shisa é um antagonista das vias de sinalização de Wnt (do inglês Wingless/Integrated family members) e FGF (do inglês fibroblast growth factor) que funciona de forma autónoma da célula no reticulo endoplasmático. No interior do retículo endoplasmático, Shisa liga-se à forma imatura dos receptores de Frizzled e FGF e impede as modificações pós-translacionais necessárias para as suas funções. Em Xenopus laevis existem dois genes ortólogos de Shisa, o XShisa e o XShisa-2. Neste trabalho o padrão de expressão de Shisa-2 é caracterizado. XShisa- 2 possui 30,1% de homologia com XShisa enquanto que com Shisa de ratinho este apresenta maior homologia, 76,9%. A análise da expressão deste gene por RT-PCR (reacção de polimerase em cadeia com transcriptase reversa) mostrou que este é expresso desde o início do desenvolvimento embrionário e que a sua expressão aumenta de intensidade no início da fase de neurula. Por hibridação in situ foi possível observar que XShisa-2 não é expresso na ADE, mas sim é expresso inicialmente na fase final de gástrula sob a forma de duas riscas na zona dorsal do embrião, a mesoderme pré-somitica. Mais tarde em estádios de neurula e em estádios posteriores, XShisa-2 está restrito à mesoderme pré-somitica e sómitos. Em embriões de Xenopus, durante as fases de gástrula, a mesoderme paraxial ou présomitica é originada a partir de duas regiões simétricas da zona marginal localizadas em cada lado do organizador de Spemann e estende-se para a região ventral do embrião. A camada superficial desta região dá origem à endoderme dorsal. Os precursores da mesoderme paraxial estão localizados na zona marginal do embrião e na fase final de blástula já estão prédeterminados para originar tecido muscular. A formação dos sómitos inicia-se imediatamente a seguir à vesícula óptica e continua sequencialmente com um novo par de sómitos a ser acrescentado no sentido da cauda até atingir um número específico de cada espécie. Os sómitos vão dar origem mais tarde no desenvolvimento a músculo-esquelético, ao esqueleto axial e a parte da derme. Outro gene encontrado neste rastreio foi o gene de ratinho ADTK1 (do inglês Anterior distal Tyrosine Kinase 1). Este gene codifica uma proteína com 493 aminoácidos e com um domínio Serina/Treonina/Tirosina quinase. Em fases inicias de desenvolvimento este é expresso na AVE (E6.5) e mais tarde a E7.5 é restrito à endoderme anterior definitiva e à mesoderme anterior, mas não é expresso na notocorda. A estádio E8.0 este gene é expresso também na placa précordal. Com o avançar do desenvolvimento, ADTK1 é expresso em diversas estruturas como na linha média da placa neural na região média do cérebro, nas margens laterais da placa neural posterior à região metencefálica e de forma mais fraca no mesénquima anterior. Com este gene foi efectuada uma pesquisa nas bases de dados do NCBI e dois ortólogos do gene ADTK1 foram encontrados em Xenopus, o XADTK1 (do inglês Xenopus Anterior Distal Tyrosine Kinase 1) e o XADTK2 (do inglês Xenopus Anterior Distal Tyrosine Kinase 2), os quais codificam também um domínio Serina/Treonina/Tirosina quinase. Na última parte deste trabalho, o novo gene XADTK2 foi caracterizado e a sua função no desenvolvimento embrionário de Xenopus foi analisada através de vários estudos de ganho e perda de função. XADTK2 codifica uma proteína com 449 aminoácidos e com 42% de identidade com ADTK1. O seu domínio Serina/Treonina/Tirosina quinase situa-se entre os aminoácidos 89 e 336 e partilha 57,8% de identidade com o mesmo domínio catalítico de ADTK1 de ratinho. A análise bioinformática identificou algumas mutações nos domínios consenso das proteínas tirosina quinase que levaram à conclusão que esta proteína não tem actividade catalítica. A análise temporal de expressão do gene XADTK2 mostrou que este gene é expresso maternalmente, mas num nível muito baixo aumentando os níveis de expressão desde a fase de blástula até ao fim da gastrulação. A expressão é mantida durante as fases de neurula decrescendo mais tarde em fases larvares do desenvolvimento. A análise espacial da expressão de XADTK2 durante o desenvolvimento embrionário permitiu observar que no inicio da gástrula, XADTK2 é expresso no lábio dorsal do blastoporo e na ADE, enquanto mais tarde, a estádio 12 é expresso na mesoderme evolutiva. Em fase de neurula, os transcritos deste gene podem ser encontrados na mesoderme paraxial e na placa pré-cordal e mais tarde, em estádios larvares, podem ser encontrados não só no sistema digestivo anterior, mas também na região da cabeça e notocorda. Em experiências de perda de função foi demonstrado que XADTK2 é necessário para a formação da crista neural e para o fecho do tubo neural. A injecção de um oligonucleótido morfolino complementar ao gene XADTK2 provocou defeitos tanto no fecho do tubo neural como na formação da crista neural e dos seus derivativos. Um estudo de perturbação de eixos efectuado com cloreto de lítio e radiações ultravioletas demonstraram também que a expressão de XADTK2 é regulada pela via de sinalização canónica de Wnt. A construção de um plasmídeo contendo a sequência codificante de XADTK2 e um gene repórter YFP (do inglês yellow fluorescent protein) permitiu observar que a proteína XADTK2 é expressa no citoplasma das células animais. A formação do coração e do sistema circulatório é outro processo que tem suscitado um elevado número de experiências ao longo dos anos. O sistema circulatório é composto pelo coração, células sanguíneas e vasos e é a primeira estrutura a formar-se e tornar-se funcional durante o desenvolvimento dos vertebrados. O desenvolvimento do coração é um processo muito conservado entre as várias espécies de vertebrados e é constituído por três grandes etapas sequenciais: especificação dos campos do coração, migração das células pré-cardíacas e a rotação do coração. Os processos que regulam a formação do coração não estão ainda bem estudados e definidos, embora se acredite que os sinais responsáveis pela indução do coração provêm da endoderme dorsal anterior. Foi demonstrado em galinha que tanto BMPs (do inglês bone morphogenetic protein) como Wnts são necessários para a regulação do processo de indução do coração. Acredita-se que moléculas antagonistas tanto de BMPs como de Wnts são responsáveis por restringir a região cardíaca à mesoderme antero-lateral nos embriões de galinha. A acção combinada de genes pertenceste às famílias de Nkx, MADS, GATA e miocardina é considerada também um factor regulador da especificação do coração. Para melhor compreender os processos e as moléculas envolvidas no processo de formação do coração e do sistema circulatório, um rastreio de novos genes diferenciadamente expressos nas células precursoras do coração/hemangioblasto (H/HPC) foi efectuado anteriormente no nosso laboratório. Para isso um plasmídeo com um promotor de Caronte que permite que a expressão de EGFP (do inglês enhanced green fluorescent protein) ocorra apenas nas células que expressam Caronte foi electroporado em embriões de galinha e estas células foram isoladas. Com esta região isolada, efectuou-se um rastreio e 81 novos genes com expressão aumentada nesta região foram identificados. Entre eles identificou-se o gene cHEP33 (do inglês chick Heart/Hemangioblast progenitor #33) que codifica uma proteína com 239 aminoácidos e um domínio dedos de zinco. Este gene foi usado para efectuar uma pesquisa nas bases de dados do NCBI e foram encontrados homólogos para várias espécies. Entre eles, foi encontrado um homólogo deste gene em Xenopus, o gene XHEP33 (do inglês Xenopus Heart/Hemangioblast progenitor #33). A análise bioinformática deste gene mostrou que este codifica uma proteína também com 239 aminoácidos e também possui um domínio dedos de zinco entre os aminoácidos 144 e 160. Esta proteína possui uma elevada homologia com o seu homólogo de galinha, sendo 90,8% idêntico. A família de genes HEP33 foi muito conservada ao longo da evolução, visto que os homólogos existentes nas várias espécies possuem um elevado grau de homologia entre si. Neste trabalho, um estudo da expressão do gene XHEP33 foi efectuado. Hibridação in situ efectuada para o gene XHEP33 mostrou que este gene é expresso sob a forma de um anel na zona marginal, tanto na região dorsal como na região ventral de embriões em fase de blástula. No início da gastrulação, os transcritos de XHEP33 são encontrados na mesoderme dorsal tanto na zona marginal evolutiva como na não evolutiva. Mais tarde na fase de gastrulação, XHEP33 é expresso sob a forma de duas riscas na mesoderme lateral que culminam na zona dorsal do embrião. Esta é provavelmente a região de origem do coração, que actualmente se considera ser a mesoderme dorso-anterior de embriões em fase de gástrula (Sater e Jacobson, 1989, 1990). A expressão de XHEP33 sob a forma de duas riscas à volta do blastoporo sugere também que este pode estar envolvido na especificação da mesoderme da placa lateral durante a indução cardiogénica. Deste estádio em diante e até ao final da gastrulação, a mesoderme evolutiva vai migrar ao longo do eixo antero-posterior assim como a expressão de XHEP33. Este movimento parece seguir a migração da mesoderme cardíaca para a região anterior durante os movimentos da mesoderme. Em estádios de neurula, a expressão de XHEP33 vai sendo progressivamente mais forte da região anterior para a região posterior do embrião. Enquanto este gene aparenta ser expresso numa região posterior à mesoderme cardíaca, a sua expressão parece seguir a migração ventral de Nkx2.5, um marcador cardíaco. A seguir à neurulação, em fases larvares, XHEP33 é expresso nos sómitos e mesoderme não segmentada. Em fases larvares posteriores, os transcritos de XHEP33 podem ser encontrados também na notocorda, em maior parte da cabeça e na região do coração.