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Publication
Insights into molecular and cellular events involved in normal and pathological vertebral development and fusion using zebrafish as model organism
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
The
vertebral
column
and
its
units,
the
vertebrae,
are
fundamental
features,
characteristic
of
all
vertebrates.
Developmental
segregation
of
the
vertebral
bodies
as
articulated
units
is
an
intrinsic
requirement
to
guarantee
the
proper
function
of
the
spine.
Whenever
these
units
become
fused
either
during
development
or
postsegmentation,
movement
is
affected
in
a
more
or
less
severe
manner,
depending
on
the
number
of
vertebrae
affected.
Nevertheless,
fusion
may
occur
as
part
of
regular
development
and
as
a
physiological
requirement,
like
in
the
tetrapod
sacrum
or
in
fish
posterior
vertebrae
forming
the
urostyle.
In
order
to
meet
the
main
objective
of
this
PhD
project,
which
aimed
to
better
understand
the
molecular
and
cellular
events
underlying
vertebral
fusion
under
physiological
and
pathological
conditions,
a
detailed
characterization
of
the
vertebral
fusion
occurring
in
zebrafish
caudal
fin
region
was
conducted.
This
showed
that
fusion
in
the
caudal
fin
region
comprised
5
vertebral
bodies,
from
which,
only
fusion
between
[PU1++U1]
and
ural2
[U2+]
was
still
traceable
during
development.
This
involved
bone
deposition
around
the
notochord
sheath
while
fusion
within
the
remaining
vertebral
bodies
occur
at
the
level
of
the
notochord
sheath,
as
during
the
early
establishment
of
the
vertebral
bodies.
A
comparison
approach
between
the
caudal
fin
vertebrae
and
the
remaining
vertebral
column
showed
conserved
features
such
as
the
presence
of
mineralization
related
proteins
as
Osteocalcin
were
identified
throughout
the
vertebral
column,
independently
on
the
mineralization
patterns.
This
unexpected
presence
of
Osteocalcin
in
notochord
sheath,
here
identified
as
Oc1,
suggested
that
this
gene,
opposing
to
Oc2,
generally
associated
with
bone
formation
and
mature
osteoblast
activity,
is
potentially
associated
with
early
mineralization
events
including
chordacentrum
formation.
Nevertheless,
major
differences
between
caudal
fin
region
and
anterior
vertebral
bodies
considering
arch
histology
and
mineralization
patterns,
led
us
to
use
RA
as
an
inductive
factor
for
vertebral
fusion,
allowing
a
direct
comparison
of
equivalent
structures
under
normal
and
fusion
events.
This
fusion
phenotype
was
associated
with
notochord
sheath
ectopic
mineralization
instead
of
ectopic
perichordal
bone
formation
related
with
increased
osteoblast
activity,
as
suggested
in
previous
reports.
Additionally,
alterations
in ECM
content,
cell
adhesion
and
blood
coagulation
were
discussed
as
potentially
related
with
the
fusion
phenotype.
Finally,
Matrix
gla
protein,
upregulated
upon
RA
treatment
and
shown
to
be
associated
with
chordacentrum
mineralization
sites
in
regular
development,
was
further
described
considering
its
potential
function
in
vertebral
formation
and
pathological
fusion.
Therefore
with
this
work
we
propose
zebrafish
caudal
fin
vertebral
fusion
as
a
potential
model
to
study
both
congenital
and
postsegmentation
fusion
and
we
present
candidate
factors
and
genes
that
may
be
further
explored
in
order
to
clarify
whether
we
can
prevent
vertebral
fusion.
A coluna vertebral e as sua unidade estrutural, a vértebra, são componentes fundamentais, transversais a todos os vertebrados. A separação dos corpos vertebrais durante o desenvolvimento como unidades articuladas é um requisito necessário para que a coluna vertebral desempenhe a sua função de forma adequada. Quando as vértebras fundem durante o desenvolvimento ou após a formação da vértebra, a mobilidade do individuo é afectada de uma forma mais ou menos severa, dependendo do número de vértebras afectadas. No entanto, é de considerar que a fusão vertebral também ocorre como requisito fisiológico durante o desenvolvimento, tal como acontece na região sacral dos tetrápodes ou no uróstilo dos teleósteos. Este doutoramento tem como objectivo compreender os mecanismos moleculares e celulares por trás da fusão vertebral em condições fisiológicas e patológicas, utilizando o peixe zebra como modelo. Para o efeito, aprofundou-‐se caracterização da fusão vertebral da região da barbatana caudal do peixe zebra. Esta caracterização demonstrou que a região da barbatana caudal resulta da fusão de cinco corpos vertebrais em vez de três como originalmente descrito. No entanto apenas a fusão entre [PU1++U1] e ural2 [U2+] ocorre em todos os indivíduos durante o desenvolvimento. Por outro lado, as restantes fusões raramente são observadas, e resultam do desenvolvimento directo do corpo vertebral composto. No caso da fusão entre [PU1++U1] e ural2 [U2+], a mineralização da região intervertebral ocorre em torno da notocorda, com formação de matriz óssea mineralizada, após formação segmentada do vértebras. Esta fusão é considerada uma fusão ontogénica, comparável com fusão pós-‐natal. De igual modo, a fusão entre os restantes corpos ocorre a nível da matriz da notocorda, tal como a mineralização do próprio corpo vertebral, sugerindo uma interferência da segmentação vértebra. Este tipo de fusão, classificada como fusão evolutiva, estará mais próxima de um processo congénito onde a segmentação da vértebra não chega a ser estabelecida. De modo a obter estruturas de referencia onde não ocorre fusão vertebral para o estudo comparativo com a região da barbatana caudal, foi feita uma caracterização detalhada da coluna vertebral completa do peixe zebra. Esta análise demonstrou que independentemente da região vertebral, proteínas associadas ao processo de mineralização como a Osteocalcina, estão presentes na matriz da notocorda durante a primeira fase de mineralização do cordacentro. A presença inesperada desta proteína numa matriz não óssea, traduziu-‐se numa caracterização mais detalhada dos dois genes Oc presentes no peixe zebra. Deduziu-‐se que estávamos na presença de Oc1, uma vez que a expressão da Oc2 aparece em fases mais tardias, potencialmente associada à formação de osso. Apesar deste ponto comum, foram identificados processos de mineralização distintos entre as vértebras da região da barbatana caudal e restantes, associados a morfologias distintas e eventualmente aliados à predisposição da vértebra para fundir ou não. Uma vez que uma análise meta-‐transcriptómica exige um cuidado considerável na selecção das amostras a utilizar, concluímos que comparar a região da barbatana caudal com uma região anterior traria um grande número de genes associados à morfologia distinta, mascarando genes potencialmente associados ao processo de fusão. Deste modo, após uma pesquisa bibliográfica detalhada, verificámos que com exposição a ácido retinóico durante o desenvolvimento das vértebras obteríamos um fenótipo de fusão vertebral que poderia ser comparado com o mesmo tipo de vértebras em condições controlo. Após uma análise por microarray, foi obtido um conjunto considerável de genes, potencialmente associados aos mecanismos de fusão vertebral. Alguns destes genes foram então associados com as várias alterações verificadas a nível morfológico, em particular com alterações da notocorda, que incluíam mineralização ectópica da matriz e não formação pericordal de osso por aumento de actividade osteoblástica, como previamente sugerido. Os grupos dominantes de genes regulados na presença de ácido retinóico incluíam componentes de matriz extracelular, adesão celular e coagulação sanguínea, os quais foram discutidos no contexto de fusão vertebral. Finalmente, a proteína gla da matriz (Mgp), identificada como sobre-‐expressa 25x na presença de ácido retinóico, foi relacionada com os locais de mineralização do cordacentro no desenvolvimento regular da coluna vertebral. Simultaneamente, foi feita uma análise detalhada dos níveis de expressão deste gene ao longo do desenvolvimento e em diferentes tecidos, tendo sido identificado em fases iniciais do desenvolvimento embrionário e em todos os tecidos analisados. O bloqueio da tradução da Mgp durante o desenvolvimento embrionário levou à malformação do embrião, com redução do alongamento da parte caudal do organismo. Estudos anteriores em membros de galinha levaram à conclusão que a Mgp poderia estar associada ao processo de diferenciação celular. Esta referência juntamente com os nossos resultados leva à hipótese de que a Mgp posso ter uma função distinta ou complementar à descrita a nível da inibição da mineralização, podendo estar associada ao processo de desenvolvimento e fusão vertebral. Para validar esta questão é necessária uma análise funcional com expressão manipulada da Mgp, verificando se tem a capacidade induzir fusão em vértebras separadas, ou prevenir fusão nas vértebras da região da barbatana caudal. Deste modo, introduzimos a região vertebral da barbatana caudal como potencial modelo onde é possível estudar fusão congénita e post-‐natal. Simultaneamente, propomos um conjunto de genes potencialmente associados ao processo de fusão, que poderão ser explorados de futuro na tentativa de encontrar um factor que permita prevenir fusão vertebral.
A coluna vertebral e as sua unidade estrutural, a vértebra, são componentes fundamentais, transversais a todos os vertebrados. A separação dos corpos vertebrais durante o desenvolvimento como unidades articuladas é um requisito necessário para que a coluna vertebral desempenhe a sua função de forma adequada. Quando as vértebras fundem durante o desenvolvimento ou após a formação da vértebra, a mobilidade do individuo é afectada de uma forma mais ou menos severa, dependendo do número de vértebras afectadas. No entanto, é de considerar que a fusão vertebral também ocorre como requisito fisiológico durante o desenvolvimento, tal como acontece na região sacral dos tetrápodes ou no uróstilo dos teleósteos. Este doutoramento tem como objectivo compreender os mecanismos moleculares e celulares por trás da fusão vertebral em condições fisiológicas e patológicas, utilizando o peixe zebra como modelo. Para o efeito, aprofundou-‐se caracterização da fusão vertebral da região da barbatana caudal do peixe zebra. Esta caracterização demonstrou que a região da barbatana caudal resulta da fusão de cinco corpos vertebrais em vez de três como originalmente descrito. No entanto apenas a fusão entre [PU1++U1] e ural2 [U2+] ocorre em todos os indivíduos durante o desenvolvimento. Por outro lado, as restantes fusões raramente são observadas, e resultam do desenvolvimento directo do corpo vertebral composto. No caso da fusão entre [PU1++U1] e ural2 [U2+], a mineralização da região intervertebral ocorre em torno da notocorda, com formação de matriz óssea mineralizada, após formação segmentada do vértebras. Esta fusão é considerada uma fusão ontogénica, comparável com fusão pós-‐natal. De igual modo, a fusão entre os restantes corpos ocorre a nível da matriz da notocorda, tal como a mineralização do próprio corpo vertebral, sugerindo uma interferência da segmentação vértebra. Este tipo de fusão, classificada como fusão evolutiva, estará mais próxima de um processo congénito onde a segmentação da vértebra não chega a ser estabelecida. De modo a obter estruturas de referencia onde não ocorre fusão vertebral para o estudo comparativo com a região da barbatana caudal, foi feita uma caracterização detalhada da coluna vertebral completa do peixe zebra. Esta análise demonstrou que independentemente da região vertebral, proteínas associadas ao processo de mineralização como a Osteocalcina, estão presentes na matriz da notocorda durante a primeira fase de mineralização do cordacentro. A presença inesperada desta proteína numa matriz não óssea, traduziu-‐se numa caracterização mais detalhada dos dois genes Oc presentes no peixe zebra. Deduziu-‐se que estávamos na presença de Oc1, uma vez que a expressão da Oc2 aparece em fases mais tardias, potencialmente associada à formação de osso. Apesar deste ponto comum, foram identificados processos de mineralização distintos entre as vértebras da região da barbatana caudal e restantes, associados a morfologias distintas e eventualmente aliados à predisposição da vértebra para fundir ou não. Uma vez que uma análise meta-‐transcriptómica exige um cuidado considerável na selecção das amostras a utilizar, concluímos que comparar a região da barbatana caudal com uma região anterior traria um grande número de genes associados à morfologia distinta, mascarando genes potencialmente associados ao processo de fusão. Deste modo, após uma pesquisa bibliográfica detalhada, verificámos que com exposição a ácido retinóico durante o desenvolvimento das vértebras obteríamos um fenótipo de fusão vertebral que poderia ser comparado com o mesmo tipo de vértebras em condições controlo. Após uma análise por microarray, foi obtido um conjunto considerável de genes, potencialmente associados aos mecanismos de fusão vertebral. Alguns destes genes foram então associados com as várias alterações verificadas a nível morfológico, em particular com alterações da notocorda, que incluíam mineralização ectópica da matriz e não formação pericordal de osso por aumento de actividade osteoblástica, como previamente sugerido. Os grupos dominantes de genes regulados na presença de ácido retinóico incluíam componentes de matriz extracelular, adesão celular e coagulação sanguínea, os quais foram discutidos no contexto de fusão vertebral. Finalmente, a proteína gla da matriz (Mgp), identificada como sobre-‐expressa 25x na presença de ácido retinóico, foi relacionada com os locais de mineralização do cordacentro no desenvolvimento regular da coluna vertebral. Simultaneamente, foi feita uma análise detalhada dos níveis de expressão deste gene ao longo do desenvolvimento e em diferentes tecidos, tendo sido identificado em fases iniciais do desenvolvimento embrionário e em todos os tecidos analisados. O bloqueio da tradução da Mgp durante o desenvolvimento embrionário levou à malformação do embrião, com redução do alongamento da parte caudal do organismo. Estudos anteriores em membros de galinha levaram à conclusão que a Mgp poderia estar associada ao processo de diferenciação celular. Esta referência juntamente com os nossos resultados leva à hipótese de que a Mgp posso ter uma função distinta ou complementar à descrita a nível da inibição da mineralização, podendo estar associada ao processo de desenvolvimento e fusão vertebral. Para validar esta questão é necessária uma análise funcional com expressão manipulada da Mgp, verificando se tem a capacidade induzir fusão em vértebras separadas, ou prevenir fusão nas vértebras da região da barbatana caudal. Deste modo, introduzimos a região vertebral da barbatana caudal como potencial modelo onde é possível estudar fusão congénita e post-‐natal. Simultaneamente, propomos um conjunto de genes potencialmente associados ao processo de fusão, que poderão ser explorados de futuro na tentativa de encontrar um factor que permita prevenir fusão vertebral.
Description
Keywords
Ciências biomédicas Fisiologia humana Coluna vertebral Desenvolvimento Mobilidade Peixe zebra