Publicação
Cloning and preliminary functional analysis of zebrafish BiP, an ATPase-Dependent endoplasmic reticulum chaperone
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais | |
| datacite.subject.sdg | 03:Saúde de Qualidade | |
| datacite.subject.sdg | 09:Indústria, Inovação e Infraestruturas | |
| datacite.subject.sdg | 14:Proteger a Vida Marinha | |
| dc.contributor.advisor | Melo, Eduardo José Xavier Rodrigues de Pinho e | |
| dc.contributor.author | Gonzalez, Alejandra Febus | |
| dc.date.accessioned | 2026-07-09T15:12:44Z | |
| dc.date.available | 2026-07-09T15:12:44Z | |
| dc.date.issued | 2025-11-10 | |
| dc.description.abstract | The endoplasmic reticulum chaperone BiP (Binding immunoglobulin Protein) plays a fundamental role in protein homeostasis, mediated by its ATPase activity. To investigate the evolutionary conservation and functionality of BiP in vertebrates, we cloned the open reading frame of Danio rerio BiP (zebrafishBiP, Uniprot Q7SZD3) into a pTrcHis-A vector for heterologous expression in Escherichia coli. The open reading frame cloned excluded the N-terminal signal peptide and the highly acidic sequence of eight amino acids after the peptide signal to align expression with previously studied mammalian BiP from Mesocricetus auratus (golden hamster, Uniprot P07823). Following PCR amplification, enzymatic digestion, ligation, and bacterial transformation, colonies were screened via colony PCR and sequencing. One clone, B1, showed 99.73% identity with the Uniprot reference, as two missense mutations (Pro→Leu) were identified. Preliminary functional assays using the malachite green method confirmed ATPase activity of hamster BiP, paving the way to test if recombinant zfBiP is biochemically active. These results lay the foundation for comparative analyses of BiP functionality across species and its potential role in the endoplasmic reticulum proteostasis and protein disaggregation. | eng |
| dc.description.abstract | A proteína BiP (Binding immunoglobulin Protein), também conhecida como GRP78, é uma chaperona dependente de ATP localizada no retículo endoplasmático (RE) e desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase proteica celular. Como membro da família Hsp70, a BiP atua nos processos de enovelamento, montagem, transporte e degradação de proteínas, além de ser um componente central da resposta a proteínas mal enoveladas (UPR, Unfolded Protein Response). O presente estudo teve como objetivo a clonagem molecular e a caracterização funcional preliminar da BiP de Danio rerio (zfBiP), com o intuito de avaliar a sua conservação evolutiva e funcionalidade comparada a ortólogos de mamíferos. Essa abordagem baseia-se na hipótese de que as chaperonas dependentes de ATP apresentam alto grau de conservação estrutural e funcional ao longo da evolução dos vertebrados, refletindo sua importância universal na proteostase e nos mecanismos celulares de resposta ao estresse. A sequência codificante aberta (ORF) da BiP de Danio rerio (Uniprot Q7SZD3) foi clonada no vetor de expressão pTrcHis-A, que contém um promotor trc fortemente induzido por IPTG, permitindo a expressão heteróloga em Escherichia coli. De forma a alinhar a expressão da BiP de peixe-zebra às condições experimentais previamente utilizadas com a BiP de hamster dourado (Mesocricetus auratus, Uniprot P07823), a região N-terminal correspondente ao peptídeo sinal e à sequência adjacente altamente ácida de oito aminoácidos foi removida da ORF. Essa exclusão, justifica-se pelo fato de que o peptídeo sinal é funcional apenas em células eucarióticas e sua presença poderia comprometer a expressão e a solubilidade da proteína em sistemas bacterianos. O processo experimental incluiu múltiplas etapas de biologia molecular: amplificação do gene por PCR a partir de cDNA, digestão dupla com enzimas de restrição NheI e BamHI, ligação do inserto ao vetor, transformação bacteriana em células competentes de E. coli STBL3 e triagem das colônias transformadas por PCR de colônia. A análise das colônias positivas foi seguida por purificação de plasmídeos (mini-prep) e sequenciação. Entre as amostras obtidas, a colônia denominada B1 apresentou a sequência mais fiel ao gene de referência, com 99,73% de identidade com a sequência depositada no banco de dados Uniprot. Foram identificadas duas mutações do tipo missense (Pro→Leu) nas posições 339 e 378, possivelmente resultantes de erros cometidos pela polimerase ou variantes naturais da espécie. Estas substituições podem alterar propriedades da proteína, como flexibilidade estrutural ou estabilidade térmica, e, portanto, requerem investigação futura para elucidar possíveis impactos funcionais. Para validar o sistema experimental e os métodos de análise bioquímica, foi realizado um ensaio preliminar de atividade ATPásica utilizando a BiP de hamster como controle positivo. Esse ensaio, baseado no método colorimétrico do verde de malaquita, quantifica o fosfato inorgânico liberado durante a hidrólise de ATP. O complexo formado entre o fosfato e o corante verde de malaquita é detetado por espectrofotometria a 623 nm, sendo a intensidade da cor proporcional à atividade enzimática. Os resultados confirmaram a atividade ATPásica esperada para a BiP de hamster, demonstrando que as condições experimentais — composição do tampão, temperatura, tempo de incubação e proporção de reagentes — são adequadas e reprodutíveis. Essa validação estabelece a base para futuros testes comparativos de atividade entre a BiP de hamster e a zfBiP recombinante. Do ponto de vista conceitual, a escolha de Danio rerio como organismo modelo é estratégica, pois o peixe-zebra apresenta grande conservação genética com mamíferos e é amplamente utilizado em estudos de biologia molecular, desenvolvimento e doenças neurodegenerativas. A análise funcional de chaperonas como a BiP neste modelo pode oferecer insights valiosos sobre os mecanismos de controle de qualidade proteica no RE, especialmente no contexto de doenças associadas á acumulação de proteínas mal enoveladas, como Alzheimer, Parkinson e outras patologias resultantes de “misfolding” proteico. Além disso, o estudo da BiP em Danio rerio contribui para compreender como processos evolutivos moldaram a versatilidade das chaperonas no restabelecimento da homeostase celular em de condições celulares adversas, como stress oxidativo e sobrecarga proteica. A BiP exerce sua função através de um ciclo dependente de ATP, alternando entre estados conformacionais de alta e baixa afinidade pelo substrato. Na forma ligada ao ATP, a BiP adota uma conformação aberta, permitindo o rápido reconhecimento e liberação de polipeptídeos parcialmente enovelados. Após a hidrólise de ATP em ADP, ocorre uma mudança estrutural que promove o fechamento do domínio de ligação ao substrato, estabilizando temporariamente a interação com a proteína cliente. Esse ciclo é finamente regulado por co-chaperonas da família ERdj (J-domain proteins), que estimulam a atividade ATPásica, e pelos fatores de troca de nucleotídeos (NEFs), responsáveis pela liberação de ADP e reativação da BiP. Essa dinâmica confere à BiP a capacidade de monitorarizar continuamente a conformação das proteínas recém-sintetizadas, garantindo que apenas aquelas devidamente enoveladas sejam encaminhadas para o destino correto dentro da célula. No presente trabalho, o foco principal foi o desenvolvimento de uma base experimental robusta para a expressão e caracterização da BiP recombinante de peixe-zebra. A confirmação da clonagem correta, a validação do vetor de expressão e a implementação de ensaios de atividade enzimática são passos essenciais para análises comparativas posteriores. Pretende-se, em etapas futuras, expressar a zfBiP em larga escala, purificá-la por cromatografia de afinidade via His-tag e realizar ensaios funcionais detalhados, incluindo medições cinéticas de ATPase e testes de interação com proteínas modelo de agregação, como domínios J recombinantes. Esses estudos permitirão avaliar o grau de conservação funcional entre a zfBiP e suas contrapartes de mamíferos, e determinar se variações pontuais, como as mutações observadas na colônia B1, afetam a sua capacidade de catalisar a hidrólise de ATP e de prevenir agregação proteica. Os resultados obtidos até o momento demonstram o sucesso da etapa de clonagem molecular e a viabilidade do sistema de expressão bacteriano para a produção da BiP de Danio rerio. Além disso, o ensaio preliminar com a BiP de hamster confirma a funcionalidade do método adotado para a análise ATPásica, constituindo um importante passo para os estudos comparativos planejados. Essa integração entre biologia molecular e bioquímica experimental representa uma abordagem abrangente para investigar as propriedades de chaperonas endoplasmáticas num contexto evolutivo. Conclui-se que o presente trabalho estabelece as bases necessárias para futuras análises estruturais e funcionais da BiP de Danio rerio. A alta identidade com a sequência de referência e a integridade do gene clonado confirmam a eficiência do protocolo de clonagem. A metodologia padronizada poderá ser aplicada a outras chaperonas do retículo endoplasmático, como a Grp94, ampliando a compreensão dos mecanismos de homeostase proteica nos vertebrados. Num contexto mais amplo, a caracterização comparativa dessas proteínas pode fornecer insights relevantes para o desenvolvimento de terapias baseadas em chaperonas, com potencial de modular a resposta ao stress do retículo e restaurar o equilíbrio proteico em condições patológicas. Assim, o estudo da BiP de Danio rerio reforça a importância das chaperonas dependentes de ATP como pilares da estabilidade proteica celular e da defesa contra o stress proteotóxico. Os resultados obtidos nesta etapa preliminar, embora introdutórios, representam um avanço significativo na consolidação de um modelo experimental que permitirá explorar, em detalhe, a funcionalidade, a conservação evolutiva e o potencial terapêutico das chaperonas do retículo endoplasmático. | por |
| dc.identifier.tid | 204225329 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/29248 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Zebrafish | |
| dc.subject | Endoplasmic reticulum chaperone | |
| dc.subject | Cloning | |
| dc.title | Cloning and preliminary functional analysis of zebrafish BiP, an ATPase-Dependent endoplasmic reticulum chaperone | eng |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biologia Marinha |