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Establishing a Diphtheria Toxin-sensitive system for cell ablation within the embryonic small intestine in mouse
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Authors
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Abstract(s)
The mouse small intestine possesses a highly complex structure with finger-like protrusions – villi – surrounded by invaginations called the crypts of Lieberkühn. Until it reaches its mature form, the embryonic small intestine undergoes a series of morphological and molecular changes. However, little is known about the molecular program involved in the development and establishment of the mouse small intestine.
Id2, an inhibitor of DNA binding and differentiation, has been found to play a role in several biological processes, such as stem cell maintenance and tumorigenesis, and is a plausible candidate to be involved in the mechanisms mentioned above.
The present study investigated the possible Id2 role in the development of the mouse small intestine through the ablation of the Id2+ cell population via Diphtheria Toxin (DT). The work conducted aimed to establish a DT-sensitive cell system for the ablation of the Id2+ cell population in the mouse embryonic small intestine, and compare the genetic profiles between sorted Id2+ epithelial iDTR- and iDTR+ cell populations. It was also proposed to evaluate the contribution of Id2 in the emmergence of the Lgr5+ cell population.
Upon treatment of the embryos with DT, apoptosis was detected by immunohistochemistry targeting γH2AX in the iDTR+ embryos, with changes in the morphology of the iDTR+ embryonic small intestine also being showed by hematoxylin and eosin staining. Furthermore, upon cell sorting, Id2+ cells were found to be reduced when compared to control.
Gene expression of the sorted cells by qPCR also showed a decrease in Id2 levels. Analysis of the high-red iDTR+ cell population by qPCR of a panel of genes – Lgr5, PUMA, Ascl2, Wnt6, Wnt11, Sfrp5, Rspo1, Rspo3, Snai2, Smoc2, Id1, Id3, Kcnq1, Kcne3, TBP, St8sia3, Slc2a3, OneCut2 – suggests that this cell population acquires proliferative and stem cell characteristics. The analysis of the non-red iDTR+ cells genetic profile also suggests a proliferative character.
O intestino delgado de ratinho possui uma estrutura altamente complexa, apresentando protrusões – as vilosidades – rodeadas por invaginações, designadas criptas de Lieberkühn. O intestino delgado embrionário passa por uma série de alterações morfológicas e moleculares até atingir o seu estado maturo. No entanto, pouco se sabe acerca dos programas moleculares envolvidos no desenvolvimento e a maturação do intestino delgado de ratinho. O gene Id2, um inibidor de ligação do DNA e de diferenciação, é descrito como possuindo um papel relevante em vários processos biológicos, nomeadamente na manutenção de células estaminais e a tumorigénese, sendo então um possível candidato a estar envolvido nos mecanismos mencionados anteriormente. O trabalho apresentado investigou o possível envolvimento de Id2 no desenvolvimento do intestino delgado de ratinho, através da ablação da população celular Id2+ mediada pela Diphtheria Toxin (DT). Este projeto teve como objetivo estabelecer um sistema de células sensíveis à ação da DT para proceder à ablação da população celular Id2+ no intestino delgado embrionário de ratinho, bem como comparar os perfis genéticos entre células epiteliais iDTR- e iDTR+ isoladas. Outro dos objetivos propostos foi avaliar a contribuição de Id2 no aparecimento da população celular Lgr5+. Após o tratamento dos embriões com a DT, foi detetada apoptose nos embriões iDTR+, através de ensaios de imunohistoquímica, tendo como alvo γH2AX, bem como alterações na morfologia destes embriões, detetada por staining com hematoxilina e eosina. Além disso, detetou-se uma redução na população Id2+ em embriões iDTR+, comparativamente às condições controlo. Através de análise por qPCR, as células isoladas apresentaram um decréscimo da expressão de Id2. A população de células Id2+ high-red foi analisada geneticamente para o seguinte conjunto de genes – Lgr5, PUMA, Ascl2, Wnt6, Wnt11, Sfrp5, Rspo1, Rspo3, Snai2, Smoc2, Id1, Id3, Kcnq1, Kcne3, TBP, St8sia3, Slc2a3, OneCut2 –, e os resultados sugerem que esta população celular adquire características proliferativas e de células estaminais. A análise do perfil genético de células Id2+ non-red sugere igualmente um perfil proliferativo.
O intestino delgado de ratinho possui uma estrutura altamente complexa, apresentando protrusões – as vilosidades – rodeadas por invaginações, designadas criptas de Lieberkühn. O intestino delgado embrionário passa por uma série de alterações morfológicas e moleculares até atingir o seu estado maturo. No entanto, pouco se sabe acerca dos programas moleculares envolvidos no desenvolvimento e a maturação do intestino delgado de ratinho. O gene Id2, um inibidor de ligação do DNA e de diferenciação, é descrito como possuindo um papel relevante em vários processos biológicos, nomeadamente na manutenção de células estaminais e a tumorigénese, sendo então um possível candidato a estar envolvido nos mecanismos mencionados anteriormente. O trabalho apresentado investigou o possível envolvimento de Id2 no desenvolvimento do intestino delgado de ratinho, através da ablação da população celular Id2+ mediada pela Diphtheria Toxin (DT). Este projeto teve como objetivo estabelecer um sistema de células sensíveis à ação da DT para proceder à ablação da população celular Id2+ no intestino delgado embrionário de ratinho, bem como comparar os perfis genéticos entre células epiteliais iDTR- e iDTR+ isoladas. Outro dos objetivos propostos foi avaliar a contribuição de Id2 no aparecimento da população celular Lgr5+. Após o tratamento dos embriões com a DT, foi detetada apoptose nos embriões iDTR+, através de ensaios de imunohistoquímica, tendo como alvo γH2AX, bem como alterações na morfologia destes embriões, detetada por staining com hematoxilina e eosina. Além disso, detetou-se uma redução na população Id2+ em embriões iDTR+, comparativamente às condições controlo. Através de análise por qPCR, as células isoladas apresentaram um decréscimo da expressão de Id2. A população de células Id2+ high-red foi analisada geneticamente para o seguinte conjunto de genes – Lgr5, PUMA, Ascl2, Wnt6, Wnt11, Sfrp5, Rspo1, Rspo3, Snai2, Smoc2, Id1, Id3, Kcnq1, Kcne3, TBP, St8sia3, Slc2a3, OneCut2 –, e os resultados sugerem que esta população celular adquire características proliferativas e de células estaminais. A análise do perfil genético de células Id2+ non-red sugere igualmente um perfil proliferativo.
Description
Dissertação de mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2017
Keywords
Intestino delgado embrionário Ablação celular Diphtheria Toxin Id2+