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Characterization of the contribution of S-nitrosylated proteins to the aggregation of alpha-synuclein in Parkinson´s Disease
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Abstract(s)
Alpha-synuclein (-Syn) is present in Lewy Bodies and its aggregation has been associated with Parkinson's disease (PD). However, the cause of -Syn aggregation is unknown. An increase in reactive nitrogen species (RNS) in PD has been described, which can lead to oxidative posttranslational modifications such as S-nitrosylation. This chemical process involves the covalent attachment of a nitric oxide group (NO) to a cysteine thiol within a protein to generate an S-nitrosothiol (SNO). Because it does not have cysteine residues in its structure, -Syn is not a direct target of S-nitrosylation. When S-nitrosylated, enzymes such as protein disulfide isomerase (PDI) and serine racemase (SR) can cause misfolded proteins to aggregate. Nonetheless, no research has been conducted to determine how S-nitrosylation of these proteins is involved in -Syn aggregation. The current study aimed to determine how S-nitrosylation in the proteome, induced by CysNO treatment, affects -Syn aggregation and cell viability by examining the presence of -Syn aggregates and cleaved caspase-3 in SH-SY5Y cells expressing WT, A53T, or A30P -Syn. The western blot results indicate that PDI is indeed S-nitrosylated. However, SR was not proven to be S-nitrosylated. These results indicate that only one protein (PDI) may contribute to the aggregation process of - Syn. Using the immunocytochemistry technique, the percentage of transfected cells, the number of transfected cells with aggregates, the presence of cleaved caspase-3 (an indicator of cell death) and the presence of condensed/fragmented nuclei were quantified. These results showed that S-nitrosylation increases aggregation of -Syn, depending on its form. And that the amount of cytotoxicity present in cells exposed to CysNO is not significant. These studies suggest that S-nitrosylation may increase the aggregation process of -Syn. Future studies could elucidate a cause-effect between the nitrosylation of proteins such as PDI and the aggregation of -Syn.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, sendo a primeira a doença de Alzheimer. A idade é um dos fatores de risco mais importantes no desenvolvimento da DP, e os homens são mais suscetíveis do que as mulheres. Os sintomas principais da DP são a rigidez dos movimentos, bradicinesia, tremores em repouso e instabilidade postural. Existem duas formas da DP, a forma esporádica, que tem uma origem idiopática e que está associada ao envelhecimento, e a forma familiar, com uma origem genética e um início precoce. A DP está integrada no grupo de sinucleinopatias, que constituem um grupo de patologias que estão associadas à acumulação da proteína alfa-sinucleína (-Syn). Esta proteína agrega-se no tecido neuronal, originando os corpos de Lewy. O processo de neurodegenerescência evolui lentamente e propaga-se pelas diferentes áreas do sistema nervoso, nomeadamente na substantia nigra pars compacta, com a consequente perda dos neurónios dopaminérgicos e respetivos sintomas motores da doença. No entanto, a causa da agregação da -Syn é incerta. Foi demonstrado que os agregados da -Syn se propagam através de um processo de célula a célula, como os priões. Existem diferentes causas para a agregação da -Syn, incluindo mutações ou modificações traducionais. A -Syn é uma proteína solúvel que está expressa de forma abundante nas áreas pré-sinápticas e peri-nucleares do sistema nervoso central. Está envolvida na regulação da libertação de neurotransmissores, função sináptica e plasticidade sináptica. Foram identificadas várias mutações pontuais no gene SNCA da -Syn, incluindo A30P, A53E, A53T, E46K, H50Q, and G51D. Apesar de possuírem diferentes taxas de agregação, foi demonstrado que as mutações A30P e A53T podem causar oligomerização precoce, o que pode levar ao aparecimento precoce da doença. Estas mutações vão ser muito importantes ao longo deste estudo. Recentemente, verificou-se um aumento das espécies reativas de nitrogénio (RNS) na DP, o que pode levar a modificações pós-traducionais conhecidas como S nitrosilação. A S-nitrosilação consiste na ligação covalente de um grupo de óxido nítrico (-NO) a um tiol de cisteína numa proteína para gerar um S-nitrosotiol (SNO). A S-nitrosilação é uma reação que tem um papel principal na regulação da função proteica e nas vias de sinalização de vários processos fisiológicos. Já foi demonstrado que a S-nitrosilação tem capacidade de regular diversos processos celulares, como o vi metabolismo, apoptose e resposta imune. Esta reação pode causar mudanças conformacionais, estimular ou inibir a atividade proteica, modificar interações proteína proteína, e afetar a formação de agregados proteicos ou a sua localização dentro de circunstâncias fisiológicas. Como resultado, estas modificações podem ter impacto nas vias de transdução de sinais e na função neuronal. Como não tem resíduos de cisteína na sua estrutura, a -Syn não é um alvo direto desta modificação pós traducional. No entanto, existem outras proteínas que ao serem S-nitrosiladas podem levar à sua agregação e consequentemente pode levar ao aumento da sua toxicidade. Como exemplo existe a proteína dissulfureto isomerase (PDI) e a serina racemase (SR), que podem contribuir para a agregação de proteínas malconformadas. Os membros da família PDI podem formar, quebrar ou reorganizar ligações dissulfureto, para além de atuarem como chaperones moleculares e dissulfureto oxidorredutases/isomerases. Foi demonstrado que a PDI tem capacidade de bloquear a agregação da -Syn devido à sua função de chaperone e oxidorredutase. SR tem a capacidade de converter a L-serina em D-serina, que é um co-agonista de recetores glutamatérgicos. Se a SR for fisiologicamente S-nitrosilada, a sua atividade enzimática que controla as interações com o ATP é suprimida. Ainda não foram realizados estudos com o objetivo de determinar de que forma a S-nitrosilação destas proteínas está envolvida na agregação da -Syn. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar a contribuição das proteínas S-nitrosiladas, como a PDI e a SR, na agregação e toxicidade da -Syn, na linha celular neuronal humana, SH-SY5Y. Esta linha celular é isolada a partir de um neuroblastoma metastático da medula óssea. Esta linha celular apresenta um fenótipo catecolaminérgico, contém enzimas como a tirosina hidroxilase e a dopamina- - hidroxilase, e tem a capacidade de sintetizar dopamina e noradrenalina. A tirosina hidroxilase é a enzima limitadora da taxa de síntese de catecolaminas e converte a tirosina em L-DOPA, o precursor da dopamina, que é convertida em noradrenalina pela dopamina- - hidroxilase e posteriormente em adrenalina. Para além disso, esta linha celular tem a capacidade de expressar constitutivamente o gene da -Syn. De forma a determinar como a S-nitrosilação afeta a agregação da -Syn e a viabilidade celular, examinou-se a presença de agregados de -Syn e caspase-3 clivada em células SH-SY5Y previamente transfetadas com a -Syn sobreexpressa (WT) e com os genótipos mutantes da -Syn (A53T e A30P), na presença e ausência de tratamento com CysNO. Através da utilização do ensaio de vii biotin switch, técnica que permite a substituição do S-nitrosotiol pela biotina na deteção e identificação proteómica de proteínas S-nitrosiladas em células. Foi utilizado o ascorbato, como agente redutor dos nitrosotióis. As proteínas biotiniladas são purificadas através da sua captação com resina de avidina imobilizada. Neste caso, a incorporação da biotina através da via de ligações dissulfídicas é uma vantagem, porque permite uma eluição fácil através da incubação com o agente redutor, permitindo também eliminar as proteínas biotiniladas endógenas, que permanecem ligadas à avidina. De forma a detetar-se as proteínas especificas, realizou-se um western blot contra estas proteínas. Os resultados do western blot indicam que a PDI é de facto S-nitrosilada. No entanto, não se provou que a SR era S-nitrosilada. Estes resultados indicam que apenas uma proteína (PDI) poderá contribuir para o processo de agregação da -Syn. Através da utilização da técnica de imunocitoquímica, técnica laboratorial utilizada para se visualizar a localização de uma proteína pela utilização de um anticorpo primário específico, quantificou-se a percentagem de células transfetadas, o número de células transfetadas com agregados, a presença de caspase-3 clivada (indicador de morte celular) e a presença de núcleos condensados/fragmentados. Estes resultados demonstraram que a S nitrosilação aumenta agregação da -Syn, dependendo da sua forma. E que a quantidade de citotoxicidade presente nas células expostas ao CysNO não é significativa. Estes estudos sugerem que a S-nitrosilação pode aumentar o processo de agregação da -Syn. Estudos futuros puderam elucidar uma causa efeito entre a nitrosilação de proteínas como a PDI e a agregação da -Syn.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum, sendo a primeira a doença de Alzheimer. A idade é um dos fatores de risco mais importantes no desenvolvimento da DP, e os homens são mais suscetíveis do que as mulheres. Os sintomas principais da DP são a rigidez dos movimentos, bradicinesia, tremores em repouso e instabilidade postural. Existem duas formas da DP, a forma esporádica, que tem uma origem idiopática e que está associada ao envelhecimento, e a forma familiar, com uma origem genética e um início precoce. A DP está integrada no grupo de sinucleinopatias, que constituem um grupo de patologias que estão associadas à acumulação da proteína alfa-sinucleína (-Syn). Esta proteína agrega-se no tecido neuronal, originando os corpos de Lewy. O processo de neurodegenerescência evolui lentamente e propaga-se pelas diferentes áreas do sistema nervoso, nomeadamente na substantia nigra pars compacta, com a consequente perda dos neurónios dopaminérgicos e respetivos sintomas motores da doença. No entanto, a causa da agregação da -Syn é incerta. Foi demonstrado que os agregados da -Syn se propagam através de um processo de célula a célula, como os priões. Existem diferentes causas para a agregação da -Syn, incluindo mutações ou modificações traducionais. A -Syn é uma proteína solúvel que está expressa de forma abundante nas áreas pré-sinápticas e peri-nucleares do sistema nervoso central. Está envolvida na regulação da libertação de neurotransmissores, função sináptica e plasticidade sináptica. Foram identificadas várias mutações pontuais no gene SNCA da -Syn, incluindo A30P, A53E, A53T, E46K, H50Q, and G51D. Apesar de possuírem diferentes taxas de agregação, foi demonstrado que as mutações A30P e A53T podem causar oligomerização precoce, o que pode levar ao aparecimento precoce da doença. Estas mutações vão ser muito importantes ao longo deste estudo. Recentemente, verificou-se um aumento das espécies reativas de nitrogénio (RNS) na DP, o que pode levar a modificações pós-traducionais conhecidas como S nitrosilação. A S-nitrosilação consiste na ligação covalente de um grupo de óxido nítrico (-NO) a um tiol de cisteína numa proteína para gerar um S-nitrosotiol (SNO). A S-nitrosilação é uma reação que tem um papel principal na regulação da função proteica e nas vias de sinalização de vários processos fisiológicos. Já foi demonstrado que a S-nitrosilação tem capacidade de regular diversos processos celulares, como o vi metabolismo, apoptose e resposta imune. Esta reação pode causar mudanças conformacionais, estimular ou inibir a atividade proteica, modificar interações proteína proteína, e afetar a formação de agregados proteicos ou a sua localização dentro de circunstâncias fisiológicas. Como resultado, estas modificações podem ter impacto nas vias de transdução de sinais e na função neuronal. Como não tem resíduos de cisteína na sua estrutura, a -Syn não é um alvo direto desta modificação pós traducional. No entanto, existem outras proteínas que ao serem S-nitrosiladas podem levar à sua agregação e consequentemente pode levar ao aumento da sua toxicidade. Como exemplo existe a proteína dissulfureto isomerase (PDI) e a serina racemase (SR), que podem contribuir para a agregação de proteínas malconformadas. Os membros da família PDI podem formar, quebrar ou reorganizar ligações dissulfureto, para além de atuarem como chaperones moleculares e dissulfureto oxidorredutases/isomerases. Foi demonstrado que a PDI tem capacidade de bloquear a agregação da -Syn devido à sua função de chaperone e oxidorredutase. SR tem a capacidade de converter a L-serina em D-serina, que é um co-agonista de recetores glutamatérgicos. Se a SR for fisiologicamente S-nitrosilada, a sua atividade enzimática que controla as interações com o ATP é suprimida. Ainda não foram realizados estudos com o objetivo de determinar de que forma a S-nitrosilação destas proteínas está envolvida na agregação da -Syn. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar a contribuição das proteínas S-nitrosiladas, como a PDI e a SR, na agregação e toxicidade da -Syn, na linha celular neuronal humana, SH-SY5Y. Esta linha celular é isolada a partir de um neuroblastoma metastático da medula óssea. Esta linha celular apresenta um fenótipo catecolaminérgico, contém enzimas como a tirosina hidroxilase e a dopamina- - hidroxilase, e tem a capacidade de sintetizar dopamina e noradrenalina. A tirosina hidroxilase é a enzima limitadora da taxa de síntese de catecolaminas e converte a tirosina em L-DOPA, o precursor da dopamina, que é convertida em noradrenalina pela dopamina- - hidroxilase e posteriormente em adrenalina. Para além disso, esta linha celular tem a capacidade de expressar constitutivamente o gene da -Syn. De forma a determinar como a S-nitrosilação afeta a agregação da -Syn e a viabilidade celular, examinou-se a presença de agregados de -Syn e caspase-3 clivada em células SH-SY5Y previamente transfetadas com a -Syn sobreexpressa (WT) e com os genótipos mutantes da -Syn (A53T e A30P), na presença e ausência de tratamento com CysNO. Através da utilização do ensaio de vii biotin switch, técnica que permite a substituição do S-nitrosotiol pela biotina na deteção e identificação proteómica de proteínas S-nitrosiladas em células. Foi utilizado o ascorbato, como agente redutor dos nitrosotióis. As proteínas biotiniladas são purificadas através da sua captação com resina de avidina imobilizada. Neste caso, a incorporação da biotina através da via de ligações dissulfídicas é uma vantagem, porque permite uma eluição fácil através da incubação com o agente redutor, permitindo também eliminar as proteínas biotiniladas endógenas, que permanecem ligadas à avidina. De forma a detetar-se as proteínas especificas, realizou-se um western blot contra estas proteínas. Os resultados do western blot indicam que a PDI é de facto S-nitrosilada. No entanto, não se provou que a SR era S-nitrosilada. Estes resultados indicam que apenas uma proteína (PDI) poderá contribuir para o processo de agregação da -Syn. Através da utilização da técnica de imunocitoquímica, técnica laboratorial utilizada para se visualizar a localização de uma proteína pela utilização de um anticorpo primário específico, quantificou-se a percentagem de células transfetadas, o número de células transfetadas com agregados, a presença de caspase-3 clivada (indicador de morte celular) e a presença de núcleos condensados/fragmentados. Estes resultados demonstraram que a S nitrosilação aumenta agregação da -Syn, dependendo da sua forma. E que a quantidade de citotoxicidade presente nas células expostas ao CysNO não é significativa. Estes estudos sugerem que a S-nitrosilação pode aumentar o processo de agregação da -Syn. Estudos futuros puderam elucidar uma causa efeito entre a nitrosilação de proteínas como a PDI e a agregação da -Syn.
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Parkinson´s disease Alpha-synuclein S-nitrosylation Aggregation