Publicação
Zebrafish as a model to study the role of ERAP1 deficiency in Ankylosing Spondylitis
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas | |
| datacite.subject.sdg | 03:Saúde de Qualidade | |
| datacite.subject.sdg | 09:Indústria, Inovação e Infraestruturas | |
| datacite.subject.sdg | 04:Educação de Qualidade | |
| dc.contributor.advisor | Gavaia, Paulo | |
| dc.contributor.author | Domingues, Max Silva Cerdeira | |
| dc.date.accessioned | 2026-04-15T15:17:32Z | |
| dc.date.available | 2026-04-15T15:17:32Z | |
| dc.date.issued | 2025-11-11 | |
| dc.description.abstract | A espondilite anquilosante (AS) é uma doença autoimune inflamatória que afeta principalmente as articulações da coluna vertebral e sacroilíacas, tendo como principal característica clínica a fusão vertebral progressiva. Esta condição resulta em dor crónica, rigidez, hipercifose e perda da curvatura lordótica, afetando significativamente a qualidade de vida dos doentes. Devido à sua natureza complexa e multifatorial, ainda não existe cura definitiva para a AS. Embora os mecanismos patológicos não estejam totalmente esclarecidos, estudos genéticos identificaram polimorfismos associados à suscetibilidade para o desenvolvimento da doença, destacando-se mutações no gene Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1). A proteína codificada por este gene desempenha um papel essencial na regulação do sistema imunitário, nomeadamente na maturação de péptidos antigénicos apresentados por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I (MHC-I). Perturbações na função da ERAP1 têm sido implicadas na desregulação imunológica subjacente à patogénese da AS. Neste contexto, o peixe-zebra (Danio rerio) surge como um modelo promissor para o estudo da AS, devido à elevada conservação genética com os humanos, à similaridade do esqueleto axial e à sua versatilidade para manipulação genética in vivo. O objetivo principal deste trabalho foi gerar modelos mutantes para os ortólogos do gene humano ERAP1 em peixe-zebra, erap1a e erap1b, utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9, e avaliar se a sua perda de função induz um fenótipo compatível com características observadas na AS. Para isso, foram injetados “single guide RNAs” (sgRNAs) específicos nos embriões em estágios iniciais de desenvolvimento, visando a geração de mutações nos genes erap1a e erap1b. As mutações obtidas foram validadas por PCR, análise de heterodúplex e sequenciação. Nos mutantes do erap1a, foi identificada uma deleção de 7 nucleótidos resultando numa mutação “frameshift”, enquanto nos mutantes do erap1b foi identificada uma deleção genómica extensa, com inserção de elementos móveis, levando à perda total do gene. A caracterização fenotípica das gerações F1 revelou alterações esqueléticas sobretudo nas larvas erap1a:Δ7. Foi possível detetar fusões vertebrais, malformações e desorganização das estruturas ósseas nas larvas erap1a:Δ7, sendo que estas alterações não foram observadas nos indivíduos Δerap1b:insTE. Modelos estruturais gerados por previsão 3D (AlphaFold2/ColabFold) confirmaram que ambas as mutações resultam em proteínas truncadas severamente, que perdem a arquitetura em quatro domínios típico do ERAP1 humano, Estas alterações estruturais reforçam a hipótese de perda de função total. Adicionalmente, foram realizadas análises de expressão génica por qPCR, que demonstraram alterações significativas nos níveis de genes associados a processos inflamatórios e stress do reticulo endoplasmático, como tnfa, il1b, erap2 e erp44 nos mutantes erap1a:Δ7. Estes resultados apontam para uma possível ligação funcional entre a deficiência de erap1a e a desregulação de vias moleculares inflamatórias, similares às observadas na AS. A análise da expressão espacial e temporal dos genes erap1a e erap1b revelou padrões distintos. Foram extraídos RNAs de embriões e larvas em diferentes estágios de desenvolvimento, e foram também extraídos RNAs de diferentes tecidos de peixes adultos, e os níveis de expressão avaliados por qPCR. Ambos os genes mostraram expressão desde os primeiros estágios, contudo o erap1a apresentou uma expressão, mais continua ao longo do desenvolvimento, enquanto o erap1b revelou uma queda severa na sua expressão às 24 horas pós fertilização (hpf), mantendo este padrão nos restantes estágios de desenvolvimento, sugerindo possíveis funções complementares ou especializadas durante o desenvolvimento. Além disso, a análise da expressão espacial mostrou que o gene erap1a é altamente expresso em tecidos como as vértebras e a pele, enquanto o erap1b, apresenta altos níveis de expressão em tecidos como o intestino, e não se encontra expresso na pele e nas vértebras. Estes resultados, sugerem que estes genes podem ter funções especializadas em diferentes tecidos e na resposta imune. Adicionalmente, a alta expressão de erap1a nas vértebras e ausência de erap1b neste tecido, pode explicar o porquê de existirem alterações esqueléticas nos mutantes erap1a:Δ7 e não se terem observado tais observações nos mutantes Δerap1b:insTE. Em suma, os dados obtidos nesta tese indicam que a perda de função dos genes ortólogos ao ERAP1, em especial o erap1a, pode levar ao desenvolvimento de fenótipos esqueléticos compatíveis com manifestações observadas na espondilite anquilosante. Este modelo poderá, assim, contribuir significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à AS, permitindo, no futuro, a identificação de novos alvos terapêuticos ou estratégias de intervenção. | por |
| dc.description.abstract | Ankylosing spondylitis (AS) is an autoimmune bone disease that results in inflammation of the vertebral and sacroiliac joints. The primary characteristic of this pathology is vertebral fusion, caused by an elevated inflammatory and autoimmune response, leading to loss of mobility, pain in the affected areas, hyperkyphosis, and loss of lordotic curvature. Due to the highly complex and multifactorial nature of AS, there is currently no cure for this disease. Although the underlying pathological mechanism of AS is not fully understood, various polymorphisms are known to increase the susceptibility to develop this disease. Mutations in the ERAP1 gene (Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1) have been described in patients with AS. The protein encoded by this gene is essential for the regulation of the immune system and the presentation of antigens to Major Histocompatibility Complex class I molecules (MHC). It is believed that dysfunction of this protein may be crucial for the pathological development of AS. The zebrafish (Danio rerio) has been suggested as an appropriate model for studying bone pathologies due to the similarity of its axial skeleton to that of humans, as well as the high conservation of its genome and signaling pathways. In this context, this thesis aims to use the zebrafish as a potential model to study AS by inducing a deficiency in the expression of the zebrafish orthologs of the human ERAP1 gene (erap1a and erap1b) using the CRISPR-Cas9 system. By inducing deficiency in these genes, we intend to characterize the phenotype of the mutants generated and observe whether zebrafish exhibit a phenotype similar to AS and to assess whether the expression of genes involved in the inflammatory process of AS are altered, thereby potentially elucidating their role in the development of an AS-like phenotype in zebrafish. | eng |
| dc.identifier.tid | 204081912 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/28686 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Ankylosing spondylitis | |
| dc.subject | Vertebral fusion | |
| dc.subject | Inflammation | |
| dc.subject | Zebrafish | |
| dc.subject | Erap1 | |
| dc.title | Zebrafish as a model to study the role of ERAP1 deficiency in Ankylosing Spondylitis | eng |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Ciências Biomédicas- Mecanismos de Doenças |