Pre-mRNA splicing and regulation of gene expression after Drosophila egg fertilization

Prudêncio, Pedro António Pereira

http://hdl.handle.net/10400.1/15246

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Doutoramento Ciências Biomédicas_Pedro Prudêncio_2020.pdf		14.41 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Prudêncio, Pedro António Pereira

Advisor(s)

Martinho, Rui Gonçalo

Fonseca, Maria do Carmo Salazar Velez Roque da

Abstract(s)

A expressão génica depende de uma coordenação complexa entre diferentes processos, os quais dependem de muitos e diferentes fatores de regulação. Devido a essa complexidade, espera-se que isso cause restrições nos estádios de desenvolvimento mais exigentes dos organismos, e vice-versa. Neste trabalho, tentamos explorar essas restrições e como influenciam a expressão genica, a relevância desses processos sob essas restrições e quão eficientes esses processos são para se adaptar sob esses estádios de desenvolvimento. Nesse sentido, decidimo-nos focar na expressão de genes zigóticos durante as rápidas divisões nucleares antes a transição da metade da blástula (MBT) do embrião de Drosophila, em que as curtas interfases limitam o tamanho dos genes aí expressos. Sabendo também que a mitose inibe no geral tanto a transcrição de genes como o seu splicing, e uma vez que a maioria dos genes expressos nesta fase não contem intrões, nós colocámos a hipótese de que provavelmente haveria também restrições no splicing nesse mesmo estádio de desenvolvimento. De acordo com essa hipótese, dois alelos mutantes para um fator de splicing nomeado fandango e homologo ao gene Xab2, uma das subunidades to complexo NTC/Prp19 em humano, foram isolados. Estes alelos apresentam defeitos na formação da blastoderme típicos de alelos mutantes de genes zigóticos. Ao analisar os transcritos expressos, reparamos que especificamente os genes zigoticamente expresses apresentavam defeitos de splicing, defeito esse, não observado nos genes transcritos maternalmente e depositados no embrião. Além disso, a expressão ectópica materna de um transcrito zigótico foi suficiente para suprimir seus defeitos de splicing no mutante de fandango. Por fim, um pequeno transcrito zigótico modificado de forma a conter múltiplos intrões apresentou mais defeitos de splicing quando expresso no embrião do tipo selvagem, comparativamente a sua expressão maternal. Mostrando assim, a existência de um pré-requisito de splicing altamente eficiente durante o estádio de desenvolvimento embrionário inicial em Drosophila. Apesar de 70% dos genes zigóticos expressos inicialmente serem curtos e não conterem intrões, a restante percentagem preserva intrões na sua arquitetura, sendo expressos durante um estádio critico para o processo de splicing. Desta forma, e uma vez que alguns destes intrões são bastante conservados entre espécies relativamente a sua posição, questionámo-nos se estes poderiam desempenhar alguma função relevante, nomeadamente durante a expressão do próprio gene. Para testar essa hipótese, fomos testar a possível funcionalidade de dois intrões conservados pertencentes a dois genes que são expressos antes da fase MBT e muito bem caracterizados: knirps (kni) e even-skipped (eve). Pare esse efeito, foram produzidas moscas transgênicas de Drosophila contendo inserções genómicas que possuíam o respetivo gene com ou sem intrão e respetivas regiões intergénicas reguladoras. Infelizmente, não foi possível obter moscas transgénicas do gene kni, não permitindo tirar uma conclusão sobre a função desse intrão nesse gene. Surpreendentemente, ambos o transgénico de eve com e sem intrão, suprimiram completamente o fenótipo de viabilidade do alelo mutante nulo do próprio gene. Além disso, não foram observadas alterações nos níveis transcritos gerados entre os dois casos, sugerindo assim não existir uma função para este intrão testado, pelo menos nas condições testadas. Para quantificar a eficiência de splicing em embriões de Drosophila, e ver se esta varia ao longo do desenvolvimento, tirámos partido da sequenciação dos transcritos em elongação nativa (dNET-seq). Esta técnica permite identificar a posição da RNA polimerase II (Pol II) com resolução de 1 nucleótido enquanto o gene esta a ser transcrito, e estabelecer a ligação dessa posição com a informação de splicing ocorrido no transcrito. Para tal foram isolados núcleos de embriões nos estádios correspondentes ao estádio MBT (early) e pós-MBT (late). A cromatina foi consequentemente digerida com Micrococcal nuclease (MNase) de modo solubilizar os complexos contento o DNA, e o RNA nascente ligado à Pol II. Estes complexos foram imunoprecipitados usando anticorpos específicos para os resíduos fosforilados, Serina 2 e Serina 5, do Domínio carboxi-terminal (CTD) de uma das subunidades da Pol II. Por consequente o RNA contido nesses complexos foi isolado, fracionado, e ligados especificamente a adaptadores de modo a garantir que unicamente os RNAs com grupo hidroxilo 3′ terminal fossem sequenciados. Desta forma foi possível observar sinal proveniente de genes zigóticos transcricionalmente ativos no embrião, enquanto que genes expressos maternalmente e depositados nos embriões, mas transcricionalmente inativos, não apresentaram sinal significativo. Mostrando assim, que o sinal detetado era especificamente proveniente de transcritos nascentes. Verificou-se também que a eficiência na terminação da transcrição estava associada à ausência de genes proximais a jusante ao gene analisado, e curiosamente, que genes pré-MBT apresentavam essas mesmas características. Enquanto que genes sem genes posicionados nos 500 pb a jusante, apresentavam pouca densidade de Pol II jusante ao sinal de terminação, genes convergentes que se sobrepõem exibiam mais Pol II a seguir a esse mesmo sinal, transcrição essa não correlacionada com a transcrição do gene convergente. Detetámos também reads abrangendo junções recursivas de splicing e entre exões em transcritos conectados ao local ativo das moléculas de Pol II posicionadas alguns nucleotídeos a jusante dos locais de splicing recursivos e canônicos 3′. Indicando que o splicing pode ocorrer logo após um local de splicing, ou seja, muito próximo do canal de saída da Pol II. Quantificando a eficiência de splicing com base no rácio entre reads spliced e reads totais detetados nos primeiros nos primeiros 100 nucleóticos a jusante do local de splicing 3′, foi possível correlacionar essa eficiência com algumas características. Entre essas características, tanto a força do sinal de splicing presente na sequência 3′, como o alto conteúdo em nucleotidos GC e o facto dos intrões não pertencerem nem à primeira nem às últimas posições, correlacionou-se com o facto de haver mais casos com evidencia de splicing imediato. Inesperadamente, enquanto bastantes intrões curtos apresentavam evidencias de splicing imediato, concordante com o mecanismo de splicing de definição de intrão, intrões muito longos, onde era esperado splicing por definição exonica também apresentaram muitos casos em que o splicing ocorrera antes da Pol II terminar a transcrição do exão. Esta observação, argumenta que a definição de exão não é obrigatória para splicing em metazoários. Por último, e além do aumento de densidade de Pol II observado na generalidade dos exões relativamente aos intrões, encontrámos ainda padrões especificos de pausa da Pol II associados aos diferentes níveis de eficiência de splicing, sugerindo um mecanismo acoplado de splicing que diminui o alongamento da transcrição. Tal como mostrado anteriormente em células humanas, dNET-seq foi capaz de detetar snRNAs pertencentes ao spliceosoma e productos intermediárias resultantes da primeira reação de splicing, mostrando uma vez mais que o spliceosoma se associa a Pol II ativa. Esses intermediários de splicicing juntamente com casos em que reads mostram a junção dos exões, permitiram concluir que 95% dos intrões analisados podem ser removidos cotranscricionalmente.

Our aim is to explore the way developmental processes influence and are influenced by gene expression kinetics. We focused our work on Drosophila pre-midblastula transition (pre- MBT), during which the extremely fast syncytial nuclear divisions are known to impose significant constraints to transcription. Since most pre-MBT genes are intronless, we hypothesized significant constraints to splicing are also likely to occur. Accordingly, mutants for the spliceosome NineTeen complex (NTC) subunit Fandango impaired efficient splicing of pre-MBT but not maternally encoded transcripts. Furthermore, a small early zygotic transcript with multiple introns was poorly spliced in wild-type embryos, which suggests a developmental pre-requisite for highly efficient splicing during Drosophila early embryonic development. Although most pre-MBT genes are intronless, many patterning genes have evolutionary conserved introns. Given this conservation, we hypothesized that some of these introns are functionally relevant for the correct expression of these genes. Nevertheless, a large genomic construct containing an intron-deleted even-skipped (eve) transgene fully complemented the patterning defects of a eve null allele, suggesting no obvious functional requirement for this intron. In order to directly study splicing kinetics in a developing Drosophila embryo, we took advantage of the native elongating transcript sequencing (dNET-seq) to identify the position of RNA polymerase II when introns become spliced. Besides finding that most introns are cotranscriptionally spliced, we showed that in most cases this process occurs when Pol II is found paused few nucleotides past the 3′ss, which in your turn is associated to specific sequence and gene architecture features. Moreover, transcription termination efficiency was found to be associated to absence of proximal downstream genes, while genes with convergent genes show transcriptional-readthrough. Interestingly, pre-MBT genes were typically isolated and/or within large introns of other genes and splicing was typically immediate, which confirms a significant optimization of gene expression beyond small transcriptional unit size.