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Studying the role of hypoxia in Glioblastoma
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Abstract(s)
Glioblastoma (GBM), a grade IV astrocytoma, is the most common type of brain tumour. It is considered one of the most lethal of all cancers and the deadliest among primary brain tumours. It is highly aggressive and invasive, and usually diagnosed among the elderly.
GBM is characterised by the presence of hypoxic regions (low oxygen levels with around 1-3% O2 depending on the tissue, pO2 < 10 mmHg) and by the existence of a necrotic foci with pseudopalisades and microvascular hyperplasia in its surroundings. As the tumour grows its centre has less access to oxygen and nutrients provenient from the vasculature surrounding the outer layer. To address their needs, cancer cells activate several mechanisms in order to survive. Hypoxia is known to regulate several genes that are associated with angiogenesis, invasion, metabolic changes, and tumour progression. Previous results from our laboratory identified two proteins, ADM and TFRC, that are over- and under-expressed, respectively, in hypoxic GBM cells.
To better understand their role in hypoxic GBM, this study consisted in performing the knockout of ADM and TFRC in GBM biopsy-derived cell lines – UP-029 and SEBTA-023. The knockout was performed using the CRISPR-Cas9 system and the cells were analysed under normoxic and hypoxic (1% O2) conditions.
Due to the global COVID-19 pandemic, the research facilities were closed, and the experiments could not be concluded. Thus, the role of ADM and TFRC in hypoxic GBM could not be understood. It is necessary in the future, to continue this study in order to have a better insight of their function in GBM progression. The discovery of new molecular markers and therapeutic targets is crucial in order to fight this deadly type of tumour.
Glioblastoma (GBM) é classificado pela Organização Mundial de Saúde como um astrocitoma de grau IV e é o tipo de tumor do sistema nervoso central mais comum. É considerado um dos tumores mais mortíferos e o mais mortífero de entre os tumores do sistema nervoso central. GBM é altamente invasivo e agressivo e está associado com resistência à quimioterapia. GBM pode ser sub-dividido em dois tipos: primário e secundário. GBM primário é mais agressivo e a sua incidência é comum em pessoas idosas, enquanto que o GBM secundário oferece melhor prognóstico e é diagnosticado geralmente em pessoas de idade inferior a 45 anos. Pacientes com GBM têm uma sobrevivência média de menos de 15 meses após o seu diagnóstico apesar de todas as abordagens multidisciplinares utilizadas. O tratamento padrão baseia-se na realização de cirurgia (quando esta é possível) seguida de quimioterapia com temozolamida (TMZ) e radioterapia concomitante. Apesar dos vários ensaios clínicos realizados e em curso, apenas três quimioterapêuticos estão aprovados: Temozolamida, Carmustina e Bevacizumab. São necessários novos tratamentos que apresentem menos efeitos secundários e que sejam mais eficazes. Diferentes alternativas para o tratamento de GBM têm sido estudadas nos últimos anos. Entre elas pode-se enumerar: imunoterapia, como o uso de células dendríticas, vacinas peptídicas, células CAR-T, inibidores de checkpoints imunes e vírus oncolíticos; Tumour Treating Fields (TTFields) e Laser Interstitial Thermal Therapy (LITT). Existem vários ensaios clínicos em diferentes fases que podem vir a demonstrar-se promissores no futuro. GBM tem como características patológicas a existência de centro necrótico com pseudopaliçadas e hiperplasia microvascular na sua região circundante. É também caracterizado pela existência de regiões hipóxicas. Uma região é considerada hipóxica quando os níveis de oxigénio são baixos (com cerca de 1-3% O2 dependendo do tecido) com pO2 inferior a 10mmHg. À medida que o tumor cresce, a região central tem menos acesso a oxigénio e nutrientes, fornecidos pelos vasos sanguíneos, em comparação com as regiões mais superficiais. De forma a obter oxigénio e nutrientes necessários, as células cancerígenas ativam vários mecanismos de forma a sobreviverem. A hipóxia regula vários genes e proteínas que estão associados com angiogénese, invasão e reprogramação metabólica, favorecendo a progressão tumoral. Esta é uma característica do GBM e está associada à sua progressão. Adrenomedulina (ADM) é uma hormona que desempenha um efeito vasodilatador e que está sobre-expressa em vários tipos de cancro (por exemplo: cancro da mama, pulmão, próstata). ADM desempenha um papel importante no processo de angiogénese e crescimento tumoral. TFRC é um recetor de transferrina que medeia a entrada de ferro dentro da célula através de endocitose e que está expresso na superfície da maior parte das células. Tal como ADM, TFRC está expresso de forma anormal em vários tipos de cancro como por exemplo cancro da mama, cólon e ovário. Sabe-se que a hipóxia induz a transcrição de ambos os genes. Resultados obtidos anteriormente no nosso laboratório identificaram estas duas proteínas, ADM e TFRC, sobre- e sub-expressas, respetivamente, em linhas celulares de GBM. O principal objetivo deste estudo é a compreensão do papel destas duas proteínas em GBM hipóxico. Para tal, realizou-se o knockout (KO) dos genes ADM e TFRC em linhas celulares de GBM prevenientes de biópsias de pacientes – UP-029 e SEBTA-023. O knockout foi realizado utilizando o sistema de edição do genoma CRISPR-Cas9 e as células foram analisadas em condições de normóxia e hipóxia (1% O2). Para avaliar as condições de hipóxia, as células wild-type foram expostas a diferentes condições de hipóxia. As células pertencentes à linha celular UP-029 foram expostas durante 24h e 48h, as SEBTA-023 durante 6h e 24h e a presença de várias proteínas alvo de hipóxia e de HIF-1 foram analisadas (HIF-1α, HIF-2α, CA IX, NDRG1 e PDK1) através de Western Blotting. A presença das proteínas alvo em comparação com células sem tratamento confirmam as condições de hipóxia. O sistema CRISPR/Cas9 é um sistema de edição do genoma que utiliza a nuclease Caspase 9 (Cas9) para criar uma quebra da cadeia dupla num locus genómico de interesse. Esta técnica consiste na introdução de um plasmídeo CRISPR/Cas9 que contém sequências de guide RNAs (gRNAs), sequências estas que são complementares à sequência de DNA alvo, que guiam a Cas9 ao local de corte. Após o corte, a célula tenta reparar este erro e acaba por criar uma mutação Indel, realizando assim o knockout. De modo a fazer o knockout dos dois genes, foram desenhados 4 gRNAs que posteriormente foram clonados num plasmídeo CRISPR, pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) vetor V2.0. A clonagem foi confirmada e os plasmídeos foram transfetados nas duas linhas celulares – UP-029 e SEBTA-023. As células transfectadas foram analisadas através de Western Blotting. A presença de ADM não foi possível de detetar através de Western Blotting, possivelmente devido ao seu tamanho (6 kDa) ou devido a esta proteína ser secretada. Outras técnicas foram utilizadas (dotblot, ELISA, PCR) de modo a tentar ultrapassar este problema, no entanto a sua otimização não foi possível e teve de ser adiada. As células com KO de TFRC foram analisadas, no entanto não se conseguiu isolar clones com KO. A análise de células com KO de TFRC e a otimização de técnicas que comprovem a presença de ADM têm de ser continuadas, no entanto o fecho dos laboratórios devido à pandemia COVID-19, não o permitiu. Para além de continuar o isolamento de clones com KO de TRFC e ADM, é necessário avaliar o papel destas duas proteínas em condições de normóxia e hipóxia realizando ensaios funcionais. No futuro é sugerida a realização de ensaios de tubulogénese em relação às células WT e com KO de ADM. É sugerido também a realização de ensaios de viabilidade (MTS) e de sensibilidade a stress oxidativo (tratamento com H2O2) em relação a ambas as células WT e com KO de ADM e TFRC. A continuação deste estudo é necessária para uma melhor compreensão do papel destas duas proteínas, ADM e TFRC, na progressão de GBM. A descoberta de novos marcadores associados com a progressão de GBM é necessária para combater este tipo de tumor e fornecer um melhor prognóstico aos pacientes.
Glioblastoma (GBM) é classificado pela Organização Mundial de Saúde como um astrocitoma de grau IV e é o tipo de tumor do sistema nervoso central mais comum. É considerado um dos tumores mais mortíferos e o mais mortífero de entre os tumores do sistema nervoso central. GBM é altamente invasivo e agressivo e está associado com resistência à quimioterapia. GBM pode ser sub-dividido em dois tipos: primário e secundário. GBM primário é mais agressivo e a sua incidência é comum em pessoas idosas, enquanto que o GBM secundário oferece melhor prognóstico e é diagnosticado geralmente em pessoas de idade inferior a 45 anos. Pacientes com GBM têm uma sobrevivência média de menos de 15 meses após o seu diagnóstico apesar de todas as abordagens multidisciplinares utilizadas. O tratamento padrão baseia-se na realização de cirurgia (quando esta é possível) seguida de quimioterapia com temozolamida (TMZ) e radioterapia concomitante. Apesar dos vários ensaios clínicos realizados e em curso, apenas três quimioterapêuticos estão aprovados: Temozolamida, Carmustina e Bevacizumab. São necessários novos tratamentos que apresentem menos efeitos secundários e que sejam mais eficazes. Diferentes alternativas para o tratamento de GBM têm sido estudadas nos últimos anos. Entre elas pode-se enumerar: imunoterapia, como o uso de células dendríticas, vacinas peptídicas, células CAR-T, inibidores de checkpoints imunes e vírus oncolíticos; Tumour Treating Fields (TTFields) e Laser Interstitial Thermal Therapy (LITT). Existem vários ensaios clínicos em diferentes fases que podem vir a demonstrar-se promissores no futuro. GBM tem como características patológicas a existência de centro necrótico com pseudopaliçadas e hiperplasia microvascular na sua região circundante. É também caracterizado pela existência de regiões hipóxicas. Uma região é considerada hipóxica quando os níveis de oxigénio são baixos (com cerca de 1-3% O2 dependendo do tecido) com pO2 inferior a 10mmHg. À medida que o tumor cresce, a região central tem menos acesso a oxigénio e nutrientes, fornecidos pelos vasos sanguíneos, em comparação com as regiões mais superficiais. De forma a obter oxigénio e nutrientes necessários, as células cancerígenas ativam vários mecanismos de forma a sobreviverem. A hipóxia regula vários genes e proteínas que estão associados com angiogénese, invasão e reprogramação metabólica, favorecendo a progressão tumoral. Esta é uma característica do GBM e está associada à sua progressão. Adrenomedulina (ADM) é uma hormona que desempenha um efeito vasodilatador e que está sobre-expressa em vários tipos de cancro (por exemplo: cancro da mama, pulmão, próstata). ADM desempenha um papel importante no processo de angiogénese e crescimento tumoral. TFRC é um recetor de transferrina que medeia a entrada de ferro dentro da célula através de endocitose e que está expresso na superfície da maior parte das células. Tal como ADM, TFRC está expresso de forma anormal em vários tipos de cancro como por exemplo cancro da mama, cólon e ovário. Sabe-se que a hipóxia induz a transcrição de ambos os genes. Resultados obtidos anteriormente no nosso laboratório identificaram estas duas proteínas, ADM e TFRC, sobre- e sub-expressas, respetivamente, em linhas celulares de GBM. O principal objetivo deste estudo é a compreensão do papel destas duas proteínas em GBM hipóxico. Para tal, realizou-se o knockout (KO) dos genes ADM e TFRC em linhas celulares de GBM prevenientes de biópsias de pacientes – UP-029 e SEBTA-023. O knockout foi realizado utilizando o sistema de edição do genoma CRISPR-Cas9 e as células foram analisadas em condições de normóxia e hipóxia (1% O2). Para avaliar as condições de hipóxia, as células wild-type foram expostas a diferentes condições de hipóxia. As células pertencentes à linha celular UP-029 foram expostas durante 24h e 48h, as SEBTA-023 durante 6h e 24h e a presença de várias proteínas alvo de hipóxia e de HIF-1 foram analisadas (HIF-1α, HIF-2α, CA IX, NDRG1 e PDK1) através de Western Blotting. A presença das proteínas alvo em comparação com células sem tratamento confirmam as condições de hipóxia. O sistema CRISPR/Cas9 é um sistema de edição do genoma que utiliza a nuclease Caspase 9 (Cas9) para criar uma quebra da cadeia dupla num locus genómico de interesse. Esta técnica consiste na introdução de um plasmídeo CRISPR/Cas9 que contém sequências de guide RNAs (gRNAs), sequências estas que são complementares à sequência de DNA alvo, que guiam a Cas9 ao local de corte. Após o corte, a célula tenta reparar este erro e acaba por criar uma mutação Indel, realizando assim o knockout. De modo a fazer o knockout dos dois genes, foram desenhados 4 gRNAs que posteriormente foram clonados num plasmídeo CRISPR, pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) vetor V2.0. A clonagem foi confirmada e os plasmídeos foram transfetados nas duas linhas celulares – UP-029 e SEBTA-023. As células transfectadas foram analisadas através de Western Blotting. A presença de ADM não foi possível de detetar através de Western Blotting, possivelmente devido ao seu tamanho (6 kDa) ou devido a esta proteína ser secretada. Outras técnicas foram utilizadas (dotblot, ELISA, PCR) de modo a tentar ultrapassar este problema, no entanto a sua otimização não foi possível e teve de ser adiada. As células com KO de TFRC foram analisadas, no entanto não se conseguiu isolar clones com KO. A análise de células com KO de TFRC e a otimização de técnicas que comprovem a presença de ADM têm de ser continuadas, no entanto o fecho dos laboratórios devido à pandemia COVID-19, não o permitiu. Para além de continuar o isolamento de clones com KO de TRFC e ADM, é necessário avaliar o papel destas duas proteínas em condições de normóxia e hipóxia realizando ensaios funcionais. No futuro é sugerida a realização de ensaios de tubulogénese em relação às células WT e com KO de ADM. É sugerido também a realização de ensaios de viabilidade (MTS) e de sensibilidade a stress oxidativo (tratamento com H2O2) em relação a ambas as células WT e com KO de ADM e TFRC. A continuação deste estudo é necessária para uma melhor compreensão do papel destas duas proteínas, ADM e TFRC, na progressão de GBM. A descoberta de novos marcadores associados com a progressão de GBM é necessária para combater este tipo de tumor e fornecer um melhor prognóstico aos pacientes.
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Glioblastoma (gbm) Hipóxia Adrenomedulina (adm) Recetor da transferrina (tfrc) Crispr-cas9