Loading...
Publication
Improvement of microalgal biomass using physiological and genetic approaches
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 3.84 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Microalgae are sustainable biological feedstocks of proteins, carbohydrates, and lipids
rich in high-valuable carotenoids and n-3 fatty acids. To facilitate the application of microalgal
biomass to food, feed and pharmaceutical markets, microalgal compounds extraction and
production needs to be improved. In this thesis, carotenoid extraction was optimised using the
euryhaline microalga Tetraselmis striata CTP4, which is known for its mechanical resistant
cell covering. Glass bead-assisted disruption using wet biomass and acetone led to the best
carotenoid recovery from this species. The same disruption method was afterwards
successfully applied to the freshwater species Chlorella vulgaris. Thereafter, the carotenoid
and EPA production of the obligate photoautotroph species T. striata was optimised by
physiological and genetic approaches. The highest carotenoid content of 8.48 mg g-1 DW was
achieved upon a thermal upshift from 20 to 35 °C under high light for only two days. The
carotenoid profile contained high amounts of violaxanthin, lutein and β-carotene. However,
upon random mutagenesis two norflurazon-resistant T. striata strains were isolated, displaying
carotenoid contents of up to 10.2 mg g-1 DW. Comparative gene expression analysis of these
mutants and the wildtype (CTP4) revealed the upregulation of several carotenogenesisrelated
transcripts in the novel strains. Interestingly, these mutants displayed also fatty acid
profiles enriched in EPA. A similar genetic approach applied to C. vulgaris under heterotrophic
growth resulted into chlorophyll-deficient mutants with high protein contents of up to 48.7% of
DW. Additionally, the norflurazon-resistant strain of C. vulgaris showed a deficiency in
carotenoid accumulation. Overall, this study revealed that T. striata is a promising candidate
for carotenoids and EPA production. Moreover, the mutants of C. vulgaris broaden the
potential of algal biomass for based food products. Furthermore, the study of randomly
mutagenized strains provided further insights into the regulation of metabolic pathways, being
a powerful tool for strain improvement.
As microalgas são uma fonte rica e sustentável de proteínas, glícidos e lípidos, contendo ainda compostos de valor acrescentado, como carotenoides e ácidos gordos essenciais. Comparativamente às fontes tradicionais destes compostos (por exemplo, plantas superiores, frutas e animais), as microalgas apresentam diversas vantagens, uma vez que apresentam maiores produtividades sem necessidade de terreno arável. Além disso, muitas espécies poderem ser cultivadas durante todo o ano com recurso a água salgada ou mesmo residual diminuindo a pressão sobre os recursos de água doce. Apesar destas vantagens e da crescente procura por produtos naturais, apenas algumas espécies de microalgas são exploradas industrialmente para obtenção de compostos de elevado valor, como carotenóides e ácido eicosapentenóico (EPA). Contudo, para facilitar a aplicação da biomassa microalgal no mercado alimentar, rações e produtos farmacêuticos, tanto o processo de extração como de produção destes compostos necessitam ser melhorados. Na presente dissertação, foi otimizada a extração de carotenóides na microalga eurialina Tetraselmis striata CTP4, reconhecida por apresentar uma cobertura celular resistente (teca). Um factor determinante para uma extração de rendimento elevado foi a aplicação de um método de disrupção celular. O método de rutura com a melhor recuperação de carotenóides para esta espécie foi com a utilização de biomassa húmida com recurso a esferas de vidro e acetona como solvente. Embora este método tenha sido desenvolvido para a análise e quantificação de carotenóides à escala laboratorial, o possível aumento de escala do processo para instalações industriais teve relevância na tomada de decisão em relação aos parâmetros da extração, nomeadamente na seleção de solventes, método de disrupção celular e pré-tratamento de biomassa. O mesmo método de disrupção foi posteriormente aplicado à espécie de água doce Chlorella vulgaris, também conhecida por ter uma parede celular de dupla camada. Posteriormente, procedeu-se à otimização da produção de carotenoides para a espécie obrigatória fotoautotrófica T. striata CTP4 usando uma abordagem fisiológica. O objetivo final foi avaliar o uso desta espécie como produtor-triplo, ou seja, capaz de acumular simultaneamente carotenoides, triacilgliceróis (TAGs) e ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa (LC-PUFA). Embora a depleção de azoto tenha demonstrado aumentar o conteúdo lipídico, o fator decisivo para a acumulação de carotenoides nessa espécie foi a reposição de azoto. Nessas condições, o teor mais elevado de carotenoides (8,48 ± 0,47 mg g -1 Peso Seco) foi obtido com imposição de luz elevada, 170 μmol m-2 s-1, e uma mudança térmica de 20°C para 35°C, durante dois dias. No perfil de pigmentos, detetaram-se violaxantina, luteína e β-caroteno com valores máximos de 1,64 ± 0,08; 3,17 ± 0,18 e 3,21 ± 0,18 mg g-1 PS, respetivamente. A luteína foi identificada nas células de T. striata CTP4 em crescimento ativo como um pigmento fulcral na obtenção de luz e na fotoproteção. Além disso, verificou-se que o composto EPA se encontrava aumentado em células cultivadas em condições mesofílicas comparativamente às células sujeitas a stress, sendo responsável por 3,83 ± 0,21% do total de ácidos gordos. Resumindo, na espécie em estudo, o EPA e os pigmentos usados na captação de luz, como a violaxantina e o β-caroteno, acumulam-se quando sujeitas a cultivos de intensidades de luz e temperaturas mais baixas. Contrariamente, os corpos lipídicos, provavelmente compostos por TAGs, e os pigmentos fotoprotetores tal como a luteína, zeaxantina e β-caroteno, aumentam em condições consideradas de stress. Paralelamente, foi melhorado o conteúdo em carotenoides para a estirpe T. striata CTP4, recorrendo ao método de mutagénese aleatória e combinado com a seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) e crescimento em norflurazon. Foram isolados dois mutantes resistentes ao norflurazon, ED5 e B11, com valores mais elevados de carotenoides com resultados 1,5 vezes superiores ao do controlo, com conteúdos máximos de 10,2 ± 0,4 mg g-1 PS. Devido à resistência desses mutantes ao herbicida norflurazon, esperava-se um efeito visível na expressão do gene que codifica a fitoeno-dessaturase. De facto, verificou-se que os níveis de transcrição de outros genes envolvidos na via biossintética dos carotenóides encontram-se significativamente afetados em ambos os mutantes, independentemente das condições de crescimento. Mais especificamente, em condições de stress, os níveis de transcrição dos genes PSY e PDS, que codificam a fitoeno sintase e a fitoeno dessaturase encontram-se aumentados em 1,9 e 2,0 vezes, respetivamente, em células ED5 quando comparadas com o tipo selvagem (WT). Nas mesmas condições, os níveis de transcrição de PSY e PDS também sofreram uma regulação positiva no mutante B11. O conteúdo de clorofila em ambos os mutantes foi até 60% inferior ao do WT, sugerindo um aumento da sensibilidade destas células à luz. É de destacar, também, que os perfis de ácidos gordos desses mutantes mostraram um aumento em EPA em comparação com o WT, atingindo níveis até 8,7% do total de ácidos gordos. As mudanças observadas em diferentes classes de metabólitos sugerem, assim, que as mutações geradas têm um efeito pleiotrópico no metabolismo geral das células. Uma abordagem genética semelhante à aplicada à T. striata CTP4 foi usada para melhorar a biomassa da espécie de C. vulgaris em crescimento heterotrófico. Após mutagénese química, uma estirpe amarela (MT01) e uma branca (MT02) foram isoladas representando uma diminuição de 80% e 99% no conteúdo total de clorofila e em comparação com a espécie selvagem. A cor amarela do MT01, no escuro, deveu-se principalmente à presença de luteína e na estirpe MT02 de C. vulgaris foi detetada uma deficiência na acumulação de carotenoides, com identificação de apenas o carotenoide incolor fitoeno. Notavelmente, ambos os mutantes MT01 e MT02 registaram um teor de proteína 30% e 60% superior ao WT, atingindo 39,5% e 48,7% PS, respetivamente. Os resultados sugerem que a anulação parcial da biossíntese de pigmentos é um fator que pode promover o incremento dos teores de proteína nesta espécie. Tal está provavelmente relacionado com a alteração da regulação de compostos usados para o armazenamento de azoto através, por exemplo, de um desvio para proteína de compostos azotados usados na biossíntese de clorofila. Em geral, este estudo revelou que estirpes melhoradas de T. striata CTP4 são promissoras para a produção de carotenoides e outros compostos considerados de alto valor, com aplicações nas indústrias nutra- e farmacêutica. No entanto, a redução da intensidade de cor verde e aumento do teor de proteína dos mutantes de C. vulgaris amplificam o potencial dos produtos alimentares à base de algas, como ingrediente análogos da carne. Curiosamente, o sucesso de qualquer mutagénese aleatória é altamente dependente da genética da espécie e do procedimento de seleção, pelo que esta tese fornece evidências adicionais que o desenvolvimento por meios genéticos de estirpes de microalgas biotecnologicamente relevantes é uma ferramenta muito poderosa tanto para reunir conhecimento para o melhoramento de estirpes, como para tornar produtos à base de microalgas economicamente sustentáveis.
As microalgas são uma fonte rica e sustentável de proteínas, glícidos e lípidos, contendo ainda compostos de valor acrescentado, como carotenoides e ácidos gordos essenciais. Comparativamente às fontes tradicionais destes compostos (por exemplo, plantas superiores, frutas e animais), as microalgas apresentam diversas vantagens, uma vez que apresentam maiores produtividades sem necessidade de terreno arável. Além disso, muitas espécies poderem ser cultivadas durante todo o ano com recurso a água salgada ou mesmo residual diminuindo a pressão sobre os recursos de água doce. Apesar destas vantagens e da crescente procura por produtos naturais, apenas algumas espécies de microalgas são exploradas industrialmente para obtenção de compostos de elevado valor, como carotenóides e ácido eicosapentenóico (EPA). Contudo, para facilitar a aplicação da biomassa microalgal no mercado alimentar, rações e produtos farmacêuticos, tanto o processo de extração como de produção destes compostos necessitam ser melhorados. Na presente dissertação, foi otimizada a extração de carotenóides na microalga eurialina Tetraselmis striata CTP4, reconhecida por apresentar uma cobertura celular resistente (teca). Um factor determinante para uma extração de rendimento elevado foi a aplicação de um método de disrupção celular. O método de rutura com a melhor recuperação de carotenóides para esta espécie foi com a utilização de biomassa húmida com recurso a esferas de vidro e acetona como solvente. Embora este método tenha sido desenvolvido para a análise e quantificação de carotenóides à escala laboratorial, o possível aumento de escala do processo para instalações industriais teve relevância na tomada de decisão em relação aos parâmetros da extração, nomeadamente na seleção de solventes, método de disrupção celular e pré-tratamento de biomassa. O mesmo método de disrupção foi posteriormente aplicado à espécie de água doce Chlorella vulgaris, também conhecida por ter uma parede celular de dupla camada. Posteriormente, procedeu-se à otimização da produção de carotenoides para a espécie obrigatória fotoautotrófica T. striata CTP4 usando uma abordagem fisiológica. O objetivo final foi avaliar o uso desta espécie como produtor-triplo, ou seja, capaz de acumular simultaneamente carotenoides, triacilgliceróis (TAGs) e ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa (LC-PUFA). Embora a depleção de azoto tenha demonstrado aumentar o conteúdo lipídico, o fator decisivo para a acumulação de carotenoides nessa espécie foi a reposição de azoto. Nessas condições, o teor mais elevado de carotenoides (8,48 ± 0,47 mg g -1 Peso Seco) foi obtido com imposição de luz elevada, 170 μmol m-2 s-1, e uma mudança térmica de 20°C para 35°C, durante dois dias. No perfil de pigmentos, detetaram-se violaxantina, luteína e β-caroteno com valores máximos de 1,64 ± 0,08; 3,17 ± 0,18 e 3,21 ± 0,18 mg g-1 PS, respetivamente. A luteína foi identificada nas células de T. striata CTP4 em crescimento ativo como um pigmento fulcral na obtenção de luz e na fotoproteção. Além disso, verificou-se que o composto EPA se encontrava aumentado em células cultivadas em condições mesofílicas comparativamente às células sujeitas a stress, sendo responsável por 3,83 ± 0,21% do total de ácidos gordos. Resumindo, na espécie em estudo, o EPA e os pigmentos usados na captação de luz, como a violaxantina e o β-caroteno, acumulam-se quando sujeitas a cultivos de intensidades de luz e temperaturas mais baixas. Contrariamente, os corpos lipídicos, provavelmente compostos por TAGs, e os pigmentos fotoprotetores tal como a luteína, zeaxantina e β-caroteno, aumentam em condições consideradas de stress. Paralelamente, foi melhorado o conteúdo em carotenoides para a estirpe T. striata CTP4, recorrendo ao método de mutagénese aleatória e combinado com a seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) e crescimento em norflurazon. Foram isolados dois mutantes resistentes ao norflurazon, ED5 e B11, com valores mais elevados de carotenoides com resultados 1,5 vezes superiores ao do controlo, com conteúdos máximos de 10,2 ± 0,4 mg g-1 PS. Devido à resistência desses mutantes ao herbicida norflurazon, esperava-se um efeito visível na expressão do gene que codifica a fitoeno-dessaturase. De facto, verificou-se que os níveis de transcrição de outros genes envolvidos na via biossintética dos carotenóides encontram-se significativamente afetados em ambos os mutantes, independentemente das condições de crescimento. Mais especificamente, em condições de stress, os níveis de transcrição dos genes PSY e PDS, que codificam a fitoeno sintase e a fitoeno dessaturase encontram-se aumentados em 1,9 e 2,0 vezes, respetivamente, em células ED5 quando comparadas com o tipo selvagem (WT). Nas mesmas condições, os níveis de transcrição de PSY e PDS também sofreram uma regulação positiva no mutante B11. O conteúdo de clorofila em ambos os mutantes foi até 60% inferior ao do WT, sugerindo um aumento da sensibilidade destas células à luz. É de destacar, também, que os perfis de ácidos gordos desses mutantes mostraram um aumento em EPA em comparação com o WT, atingindo níveis até 8,7% do total de ácidos gordos. As mudanças observadas em diferentes classes de metabólitos sugerem, assim, que as mutações geradas têm um efeito pleiotrópico no metabolismo geral das células. Uma abordagem genética semelhante à aplicada à T. striata CTP4 foi usada para melhorar a biomassa da espécie de C. vulgaris em crescimento heterotrófico. Após mutagénese química, uma estirpe amarela (MT01) e uma branca (MT02) foram isoladas representando uma diminuição de 80% e 99% no conteúdo total de clorofila e em comparação com a espécie selvagem. A cor amarela do MT01, no escuro, deveu-se principalmente à presença de luteína e na estirpe MT02 de C. vulgaris foi detetada uma deficiência na acumulação de carotenoides, com identificação de apenas o carotenoide incolor fitoeno. Notavelmente, ambos os mutantes MT01 e MT02 registaram um teor de proteína 30% e 60% superior ao WT, atingindo 39,5% e 48,7% PS, respetivamente. Os resultados sugerem que a anulação parcial da biossíntese de pigmentos é um fator que pode promover o incremento dos teores de proteína nesta espécie. Tal está provavelmente relacionado com a alteração da regulação de compostos usados para o armazenamento de azoto através, por exemplo, de um desvio para proteína de compostos azotados usados na biossíntese de clorofila. Em geral, este estudo revelou que estirpes melhoradas de T. striata CTP4 são promissoras para a produção de carotenoides e outros compostos considerados de alto valor, com aplicações nas indústrias nutra- e farmacêutica. No entanto, a redução da intensidade de cor verde e aumento do teor de proteína dos mutantes de C. vulgaris amplificam o potencial dos produtos alimentares à base de algas, como ingrediente análogos da carne. Curiosamente, o sucesso de qualquer mutagénese aleatória é altamente dependente da genética da espécie e do procedimento de seleção, pelo que esta tese fornece evidências adicionais que o desenvolvimento por meios genéticos de estirpes de microalgas biotecnologicamente relevantes é uma ferramenta muito poderosa tanto para reunir conhecimento para o melhoramento de estirpes, como para tornar produtos à base de microalgas economicamente sustentáveis.
Description
Keywords
Additionally Microalgae Producing companies Improvement of microalgae Concerning Photosynthetic Pigments