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Comparative ontogeny of European Sea bass (Dicentrarchus labrax) and gilthead sea bream (Sparus aurata) using potential biomarkers of larval quality
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Abstract(s)
Gilthead sea bream (Sparus aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax) are important aquaculture species in the Mediterranean. The hatchery production of these species is of crucial importance as it supplies the juveniles and determines the productivity and quality of the commercialized fish. The aim of the present thesis is to provide an understanding of gilthead sea bream and European sea bass larval ontogeny and the challenges faced during hatchery production. The overall goal of the project is to contribute to improve key performance indicators (KPIs) by developing molecular indicators linked to the quality of this critical production stage. To achieve the objectives, European sea bass and gilthead sea bream larvae from several production batches with four early development larval stages before the juvenile phase, were received from different hatcheries. Each batch was classified as good or bad based on skeletal malformations then larvae were prepared for molecular analysis (quantitative PCR, qPCR) to evaluate genes related to the skeleton, endocrine system, immune system, and metabolic genes. The genes used for qPCR analysis were derived from a preliminary screen of genes that clustered with “good” or “bad” batches of larva and included 9 potential candidate genes for European sea bass and 12 for Sea bream. In general, divergent expression of genes related to good and bad quality were detected at later developmental stages in the gilthead sea bream. In contrast, divergent expression of genes related to good and bad quality were detected very clearly in early to late developmental stages of European sea bass. The qPCR analysis identified 5 core quality biomarker genes strongly linked to skeletal ontogeny in Sea bream (gk, ostc, op, on and m-cad) and 2 different genes in European sea bass (try and apoa1). Further analysis on a greater number of larval production batches is required to confirm the robustness and applicability of the biomarker genes to the hatchery stage of production in industry.
A dourada (Sparus aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax) são as duas espécies mais importantes na aquacultura do Mediterrâneo. A produção destas espécies em cativeiro é de extrema importância uma vez que fornecem os juvenis às empresas de aquacultura, sendo durante a sua produção que se determina a produtividade e a qualidade do peixe que irá ser comercializado. A ontogenia das larvas e a qualidade dos juvenis são afetadas por uma série de fatores durante a fase de produção em cativeiro, além disso, os eventos que ocorrem no início do desenvolvimento têm o potencial de impactar na trajetória de desenvolvimento e o desempenho dos estados de desenvolvimento posteriores essencialmente modulando a performance dos juvenis O desenvolvimento de métodos rápidos, simples e de baixo custo para prever a qualidade das larvas e, idealmente, ligá-la ao desempenho das fases posteriores é uma prioridade para as empresas de produção de larvas no Mediterrâneo. Quanto mais cedo durante o ciclo de produção os indicadores de qualidade das larvas puderem ser definidos, maiores serão as poupanças financeiras e de tempo investido, uma vez que os lotes com fraco desempenho podem ser eliminados com antecedência. Por exemplo, algumas anomalias morfológicas externas podem ser detetadas precocemente no desenvolvimento e esses peixes podem ser removidos das culturas ou, se uma elevada proporção de um lote estiver malformada, ou mesmo a cultura pode ser interrompida. No entanto, se as malformações só se tornarem evidentes nos juvenis, isso levará a uma redução significativa no seu valor de venda, apesar de uma despesa semelhante na sua produção em comparação com os juvenis de alta qualidade. Potenciais indicadores de qualidade já são aplicados a larvas de peixes e relacionados com as características morfológicas, metabolismo ósseo, condição nutricional, potencial de crescimento e estado imunológico, mas combinando características morfológicas com a expressão de genes selecionados, pode ser uma nova abordagem poderosa para a classificação precoce da qualidade larval, mesmo antes que os sinais morfológicos se tornem óbvios. Compreender a ontogenia dos peixes relacionada ao potencial de crescimento, desenvolvimento ósseo, estado imunológico e nutricional pode ajudar a identificar os indicadores de qualidade dos peixes. O objetivo desta tese é fornecer uma resposta com aplicação na indústria de criação de larvas em viveiros, que possa contribuir para a melhoria dos principais indicadores de desempenho (KPIs) por meio de desenvolvimento de indicadores moleculares vinculados á qualidade dessa etapa crítica e sensível da produção. Assim, larvas de robalo e dourada provenientes de vários lotes de produção de diferentes companhias, com quatro estados larvares de desenvolvimento foram usados para este trabalho. Primeiramente foi criado um manual com os procedimentos de amostragem para ajudar as empresas incubadoras destas espécies que colaboraram connosco a fim de obter uma análise mais homogénea ´minimizando as possíveis diferenças inerentes á origem de cada amostra/larva. Após a receção de cada amostra foi passada por um processo de controlo qualidade, onde foi classificado a viabilidade da amostra antes de avançar com a extração de todo o lote, a verificação foi baseada na qualidade do RNA. Cada lote foi classificado como bom ou mau com base em malformações esqueléticas. As larvas foram homogeneizadas para extrair o RNA, para posterior síntese do cDNA usado para avaliar a expressão de vários genes relacionados com desenvolvimento esquelético, endócrino, imune e metabólico por qPCR, comparando os piores e melhores lotes em cada espécie dentro de cada idade larval. Os genes usados para análise qPCR foram previamente selecionados com base em pesquisa bibliográfica, onde verificamos quais os potenciais genes importantes durante a ontogenia destas duas espécies e também am genes que já tínhamos “em laboratório” relacionados com os vários processos fisiológicos e daí, 9 genes foram dados como potenciais candidatos para robalo e 12 para dourada com base na comparação de pools de amostra de larva pertencentes a maus lotes com bons lotes. Em geral, a dourada em comparação com o robalo mostrou diferenças significativas em fases mais tardias na ontogenia, na expressão dos genes potenciais, quando comparados os melhores versus os piores lotes. No robalo essas diferenças são detetadas desde o início até ao último estado larval. A análise qPCR identificou 5 genes principais de biomarcadores de qualidade fortemente ligados à ontogenia esquelética em dourada (gk, ostc, op, on e m-cad) e 2 genes diferentes em robalo (try e apoa1). Análises adicionais com um número maior de lotes de produção de larvas são necessárias para confirmar a robustez e aplicabilidade dos genes biomarcadores para a fase de incubação da produção nas indústrias de aquacultura. Este trabalho contribuiu para gerar um grande conjunto de dados e, em seguida, treinar o algoritmo num software de estatística para prever a qualidade das larvas com base em um número mínimo de genes. O resultado do trabalho da ferramenta de avaliação de qualidade desenvolvida que será brevemente mencionada aqui, pois foi desenvolvida pelos nossos parceiros da Grécia.
A dourada (Sparus aurata) e o robalo (Dicentrarchus labrax) são as duas espécies mais importantes na aquacultura do Mediterrâneo. A produção destas espécies em cativeiro é de extrema importância uma vez que fornecem os juvenis às empresas de aquacultura, sendo durante a sua produção que se determina a produtividade e a qualidade do peixe que irá ser comercializado. A ontogenia das larvas e a qualidade dos juvenis são afetadas por uma série de fatores durante a fase de produção em cativeiro, além disso, os eventos que ocorrem no início do desenvolvimento têm o potencial de impactar na trajetória de desenvolvimento e o desempenho dos estados de desenvolvimento posteriores essencialmente modulando a performance dos juvenis O desenvolvimento de métodos rápidos, simples e de baixo custo para prever a qualidade das larvas e, idealmente, ligá-la ao desempenho das fases posteriores é uma prioridade para as empresas de produção de larvas no Mediterrâneo. Quanto mais cedo durante o ciclo de produção os indicadores de qualidade das larvas puderem ser definidos, maiores serão as poupanças financeiras e de tempo investido, uma vez que os lotes com fraco desempenho podem ser eliminados com antecedência. Por exemplo, algumas anomalias morfológicas externas podem ser detetadas precocemente no desenvolvimento e esses peixes podem ser removidos das culturas ou, se uma elevada proporção de um lote estiver malformada, ou mesmo a cultura pode ser interrompida. No entanto, se as malformações só se tornarem evidentes nos juvenis, isso levará a uma redução significativa no seu valor de venda, apesar de uma despesa semelhante na sua produção em comparação com os juvenis de alta qualidade. Potenciais indicadores de qualidade já são aplicados a larvas de peixes e relacionados com as características morfológicas, metabolismo ósseo, condição nutricional, potencial de crescimento e estado imunológico, mas combinando características morfológicas com a expressão de genes selecionados, pode ser uma nova abordagem poderosa para a classificação precoce da qualidade larval, mesmo antes que os sinais morfológicos se tornem óbvios. Compreender a ontogenia dos peixes relacionada ao potencial de crescimento, desenvolvimento ósseo, estado imunológico e nutricional pode ajudar a identificar os indicadores de qualidade dos peixes. O objetivo desta tese é fornecer uma resposta com aplicação na indústria de criação de larvas em viveiros, que possa contribuir para a melhoria dos principais indicadores de desempenho (KPIs) por meio de desenvolvimento de indicadores moleculares vinculados á qualidade dessa etapa crítica e sensível da produção. Assim, larvas de robalo e dourada provenientes de vários lotes de produção de diferentes companhias, com quatro estados larvares de desenvolvimento foram usados para este trabalho. Primeiramente foi criado um manual com os procedimentos de amostragem para ajudar as empresas incubadoras destas espécies que colaboraram connosco a fim de obter uma análise mais homogénea ´minimizando as possíveis diferenças inerentes á origem de cada amostra/larva. Após a receção de cada amostra foi passada por um processo de controlo qualidade, onde foi classificado a viabilidade da amostra antes de avançar com a extração de todo o lote, a verificação foi baseada na qualidade do RNA. Cada lote foi classificado como bom ou mau com base em malformações esqueléticas. As larvas foram homogeneizadas para extrair o RNA, para posterior síntese do cDNA usado para avaliar a expressão de vários genes relacionados com desenvolvimento esquelético, endócrino, imune e metabólico por qPCR, comparando os piores e melhores lotes em cada espécie dentro de cada idade larval. Os genes usados para análise qPCR foram previamente selecionados com base em pesquisa bibliográfica, onde verificamos quais os potenciais genes importantes durante a ontogenia destas duas espécies e também am genes que já tínhamos “em laboratório” relacionados com os vários processos fisiológicos e daí, 9 genes foram dados como potenciais candidatos para robalo e 12 para dourada com base na comparação de pools de amostra de larva pertencentes a maus lotes com bons lotes. Em geral, a dourada em comparação com o robalo mostrou diferenças significativas em fases mais tardias na ontogenia, na expressão dos genes potenciais, quando comparados os melhores versus os piores lotes. No robalo essas diferenças são detetadas desde o início até ao último estado larval. A análise qPCR identificou 5 genes principais de biomarcadores de qualidade fortemente ligados à ontogenia esquelética em dourada (gk, ostc, op, on e m-cad) e 2 genes diferentes em robalo (try e apoa1). Análises adicionais com um número maior de lotes de produção de larvas são necessárias para confirmar a robustez e aplicabilidade dos genes biomarcadores para a fase de incubação da produção nas indústrias de aquacultura. Este trabalho contribuiu para gerar um grande conjunto de dados e, em seguida, treinar o algoritmo num software de estatística para prever a qualidade das larvas com base em um número mínimo de genes. O resultado do trabalho da ferramenta de avaliação de qualidade desenvolvida que será brevemente mencionada aqui, pois foi desenvolvida pelos nossos parceiros da Grécia.
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Keywords
Aquacultura Desenvolvimento larval Indicadores de qualidade Qualidade de peixe qPCR Viveiro