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Understanding new microbial communication systems to combat antimicrobial resistance
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Abstract(s)
Bacterial biofilms provide an advantageous spatial structure for colonization and cell maintenance as a community. This multicellular behaviour is regulated by a bacterial quorum-dependent mechanism, called the quorum sensing (QS) system that regulates other diverse social behaviours such as toxin production and virulence factors. This mechanism is regulated by signal molecules that regulate intra-specific, inter-specific and inter-kingdom interactions. For these reasons, this mechanism is strongly studied, as well as signalling molecules and analogues, such as alkyl-quinolone based compounds, for the disarming of pathogenic bacteria resistant to multi-drugs that plague public health worldwide. The path to a complete understanding of how this occurs, what are the conditions for such biological responses and what machinery and mechanisms exist for the perception and modulation of these interactions is still far from reaching a conclusion. Therefore, the present work seeks to evaluate compounds against behaviours dependent on the quorum sensing mechanism, as well as the effect of these compounds on the growth of harmful pathogens, such as Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Providing information to assist in understanding these microbial interactions, as well as the development of new anti-infectious strategies and the fight against antimicrobial resistance. The tested compounds confirmed activities such as anti-biofilm, anti-swarming and anti-pyocyanin production. Of the twenty-three analogous compounds to the alkyl-quinolones screened thirteen presented some type of interference between the three evaluated phenotypes, five with significant antagonistic activities against P. aeruginosa PA14 and three against staphylococcal strains, such as S. aureus, Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus hominis. Thus, it is concluded that small molecules based on alkyl-quinolones are effective bioactive against QS dependent behaviours and can assist in unravelling microbial communication and its impacts on human society.
Microrganismos podem ser considerados organismos vastamente abundantes que colonizam nichos desde o fundo oceânico até ao interior do intestino humano. Esta alta diversidade pode ser explicada pela capacidade das bactérias se comportarem como uma estrutura espacial, chamada biofilme, auxiliando os processos de defesa, competição e cooperação bacteriana. Biofilmes bacterianos fornecem uma estrutura espacial vantajosa na colonização e manutenção celular como uma comunidade. Este comportamento multicelular é regulado por um mecanismo dependente de um quorum bacteriano, chamado sistema Quorum Sensing (QS), responsável por coordenar comportamentos de um organismo unicelular de tal forma que corresponda biologicamente a uma unidade multicelular ou comunidade. O mecanismo deste sistema incorpora processos de produção, secreção e deteção de moléculas sinais ou autoindutores que, quando presentes em grande quantidade no meio exterior, penetram o interior celular e regulam a transcrição e expressão de múltiplos genes: formação de biofilme, motilidade, pigmentos, síntese de antibióticos, toxinas, fatores de virulência etc. Entretanto, autoindutores de bactérias gram-positivas são distintos de gram-negativas. O principal grupo autoindutor gram-negativo são os n-Acil-Homoserina Lactonas (AHLs) isto foi associado logo no começo das descobertas do QS em meados da década de 90, mas outras moléculas sinais são descritas, como Fator de Sinalização de Difusão (DSF) e Alquil-Quinolonas (AQ). Pseudomonas aeruginosa possui quatro sistemas distintos Las, Rhl, PQS e IQS. O sistema PQS possui como autoindutor a molécula nomeada Sinal de Quinolona de Pseudomonas (PQS), uma AQ que controla genes de virulência em conjunto com os sistemas Las e Rhl. Bactérias gram-positivas possuem oligo peptídeos ou também conhecidos como peptídeos autoindutores e consequentemente apresentam outros sistemas de QS. Um dos principais exemplos que podemos citar é o sistema Agr, em Staphylococcus aureus, que é responsável por fatores de virulência extracelulares, como hemolisinas, proteases e lipases. Porém, ao contrário do que uma vez se imaginou as moléculas sinalizadoras AQ não possuem ação somente intraespecífica. Há relatos de comunicações por AQ em esferas intraespecíficas, interespecíficas e inter-reinos. Estas interações se mostraram relevantes principalmente em coinfecções de P. aeruginosa e S. aureus, muitas vezes dificultando o tratamento e a erradicação dos microrganismos patogênicos, principalmente quando há formações de biofilme bacteriano. Associadas a isto, temos uma problemática mundial, a resistência antimicrobiana. Bactérias conhecidas como multidrug-resistant encarecem os custos governamentais e aumentam os riscos de saúde pública numa escala mundial. As bactérias ESKAPEE que incluem S. aureus e P. aeruginosa, são exemplos de patógenos que apresentam grande ameaça, devido ao rápido desenvolvimento de mecanismos de resistência. Por sua relação com a formação de biofilme, virulência e mecanismos de resistência, o mecanismo de QS é fortemente estudado. Assim como as moléculas sinalizadoras e análogos destas moléculas, na busca pelo desarme do QS e consequentemente, da virulência e patogenicidade bacteriana. O caminho para total compreensão de como isso ocorre, quais as condições para tais respostas biológicas e quais maquinarias e mecanismos existem para a percepção e modulação destas interações ainda está longe de chegar em uma conclusão. Por tanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar compostos contra comportamentos dependentes do mecanismo de QS, bem como o efeito destes compostos no crescimento de patógenos prejudiciais, como P. aeruginosa e S. aureus, de forma que forneçam informações que auxiliem na compreensão destas interações microbianas, no desenvolvimento de novas estratégias anti-infecciosas e no combate da resistência antimicrobiana. Triagens foram realizadas com a biblioteca de compostos disponibilizadas pelo departamento de microbiologia – University College Cork para a realização deste projeto. Na coleção bacteriana foram testadas P. aeruginosa PA14, uma gama de Staphylococcus spp. e Bacillus atrophaeus. Ensaios para verificação de inibição de biofilme foram avaliados seguindo o ensaio padrão de coloração com cristal violeta (0.1%), utilizando microplacas de 96 poços contendo 200 μL de cultura microbianas inoculadas com adição de compostos com concentração de 30 μM. Posteriormente, os compostos que demostraram atividade foram validados em novos testes padrão de coloração usando microplacas de 24 poços com volumes ajustados a 1 ml, com mesma concentração de composto adicionado. Análises de curvas de crescimento foram desenvolvidas em paralelo com os compostos (30 μM), utilizando o equipamento e sistema automatizado Bioscreen-C. Outros fenótipos biológicos dependentes de QS foram avaliados como motilidade bacteriana por enxameação, utilizando placas de Petri com baixas concentrações de ágar e adição de compostos a 10 μM. Assim como a quantificação da produção de piocianina com inserção dos compostos a 30 μM, através de ensaios de extração bifásica. Diferenças significativas foram determinadas por one-way ANOVA com o teste de comparação múltipla de Dunnett, bem como a geração de gráficos foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 8. Perante os compostos testados foi confirmada atividades significativas como anti-biofilme, anti-enxameação e anti-piocianina. Dos vinte e três compostos triados treze apresentaram algum tipo de interferência entre os três fenótipos avaliados, cinco com atividades antagónicas significativas contra P. aeruginosa PA14 (dois compostos mostraram redução significativa na formação de biofilme e três na produção de piocianina) e três contra o biofilme de linhagens de estafilococos, como S. aureus, Staphylococcus haemolyticus e Staphylococcus hominis. Poucos compostos interferiram no crescimento bacteriano nos microrganismos testados. Somente os compostos 04 e 09 mostraram-se bactericidas em algumas linhagens de Staphylococcus spp. e B atrophaeus. Nenhum composto interferiu com P. aeruginosa PA14. O composto 09 foi o único a apresentar atividades antagónicas nos três gêneros testados e o composto 14 mostrou-se o mais promissor perante as três análises fenotípicas avaliadas sem apresentar efeitos bactericidas. Devido ao papel fundamental nos sistemas de QS e na interação interespécie e interdomínio as AQ, bem como análogos destas moléculas, ganharam um espaço no pipeline de pesquisa e desenvolvimento de drogas antimicrobianas. Estudos anteriores demonstraram que a atividade anti-biofilme e anti-enxameação de análogos de AQ persiste após um amplo espectro de modificações das estruturas do anel de antranilato. Embora muitos trabalhos citem a resposta eficaz em moléculas com inserção ou substituição de grupos halogenados, os estudos deste trabalho revelam que a inserção nitro, corroborado por alguns trabalhos, e principalmente do grupo metil e metoxi apresentaram bons resultados invariavelmente da posição. Análises genómicas, bem como estudos polimicrobianos e avanços em estudos in vivo podem ser alvo de trabalhos futuros. Embora mais estudos necessitem ser realizados para compreensão profunda da comunicação microbiana, concluí-se que pequenas moléculas baseadas em autoindutores, tais como as AQ testadas no presente trabalho, são bioativos eficazes contra comportamentos QS dependentes e podem auxiliar no desvendamento da comunicação microbiana e seus impactos na sociedade humana.
Microrganismos podem ser considerados organismos vastamente abundantes que colonizam nichos desde o fundo oceânico até ao interior do intestino humano. Esta alta diversidade pode ser explicada pela capacidade das bactérias se comportarem como uma estrutura espacial, chamada biofilme, auxiliando os processos de defesa, competição e cooperação bacteriana. Biofilmes bacterianos fornecem uma estrutura espacial vantajosa na colonização e manutenção celular como uma comunidade. Este comportamento multicelular é regulado por um mecanismo dependente de um quorum bacteriano, chamado sistema Quorum Sensing (QS), responsável por coordenar comportamentos de um organismo unicelular de tal forma que corresponda biologicamente a uma unidade multicelular ou comunidade. O mecanismo deste sistema incorpora processos de produção, secreção e deteção de moléculas sinais ou autoindutores que, quando presentes em grande quantidade no meio exterior, penetram o interior celular e regulam a transcrição e expressão de múltiplos genes: formação de biofilme, motilidade, pigmentos, síntese de antibióticos, toxinas, fatores de virulência etc. Entretanto, autoindutores de bactérias gram-positivas são distintos de gram-negativas. O principal grupo autoindutor gram-negativo são os n-Acil-Homoserina Lactonas (AHLs) isto foi associado logo no começo das descobertas do QS em meados da década de 90, mas outras moléculas sinais são descritas, como Fator de Sinalização de Difusão (DSF) e Alquil-Quinolonas (AQ). Pseudomonas aeruginosa possui quatro sistemas distintos Las, Rhl, PQS e IQS. O sistema PQS possui como autoindutor a molécula nomeada Sinal de Quinolona de Pseudomonas (PQS), uma AQ que controla genes de virulência em conjunto com os sistemas Las e Rhl. Bactérias gram-positivas possuem oligo peptídeos ou também conhecidos como peptídeos autoindutores e consequentemente apresentam outros sistemas de QS. Um dos principais exemplos que podemos citar é o sistema Agr, em Staphylococcus aureus, que é responsável por fatores de virulência extracelulares, como hemolisinas, proteases e lipases. Porém, ao contrário do que uma vez se imaginou as moléculas sinalizadoras AQ não possuem ação somente intraespecífica. Há relatos de comunicações por AQ em esferas intraespecíficas, interespecíficas e inter-reinos. Estas interações se mostraram relevantes principalmente em coinfecções de P. aeruginosa e S. aureus, muitas vezes dificultando o tratamento e a erradicação dos microrganismos patogênicos, principalmente quando há formações de biofilme bacteriano. Associadas a isto, temos uma problemática mundial, a resistência antimicrobiana. Bactérias conhecidas como multidrug-resistant encarecem os custos governamentais e aumentam os riscos de saúde pública numa escala mundial. As bactérias ESKAPEE que incluem S. aureus e P. aeruginosa, são exemplos de patógenos que apresentam grande ameaça, devido ao rápido desenvolvimento de mecanismos de resistência. Por sua relação com a formação de biofilme, virulência e mecanismos de resistência, o mecanismo de QS é fortemente estudado. Assim como as moléculas sinalizadoras e análogos destas moléculas, na busca pelo desarme do QS e consequentemente, da virulência e patogenicidade bacteriana. O caminho para total compreensão de como isso ocorre, quais as condições para tais respostas biológicas e quais maquinarias e mecanismos existem para a percepção e modulação destas interações ainda está longe de chegar em uma conclusão. Por tanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar compostos contra comportamentos dependentes do mecanismo de QS, bem como o efeito destes compostos no crescimento de patógenos prejudiciais, como P. aeruginosa e S. aureus, de forma que forneçam informações que auxiliem na compreensão destas interações microbianas, no desenvolvimento de novas estratégias anti-infecciosas e no combate da resistência antimicrobiana. Triagens foram realizadas com a biblioteca de compostos disponibilizadas pelo departamento de microbiologia – University College Cork para a realização deste projeto. Na coleção bacteriana foram testadas P. aeruginosa PA14, uma gama de Staphylococcus spp. e Bacillus atrophaeus. Ensaios para verificação de inibição de biofilme foram avaliados seguindo o ensaio padrão de coloração com cristal violeta (0.1%), utilizando microplacas de 96 poços contendo 200 μL de cultura microbianas inoculadas com adição de compostos com concentração de 30 μM. Posteriormente, os compostos que demostraram atividade foram validados em novos testes padrão de coloração usando microplacas de 24 poços com volumes ajustados a 1 ml, com mesma concentração de composto adicionado. Análises de curvas de crescimento foram desenvolvidas em paralelo com os compostos (30 μM), utilizando o equipamento e sistema automatizado Bioscreen-C. Outros fenótipos biológicos dependentes de QS foram avaliados como motilidade bacteriana por enxameação, utilizando placas de Petri com baixas concentrações de ágar e adição de compostos a 10 μM. Assim como a quantificação da produção de piocianina com inserção dos compostos a 30 μM, através de ensaios de extração bifásica. Diferenças significativas foram determinadas por one-way ANOVA com o teste de comparação múltipla de Dunnett, bem como a geração de gráficos foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 8. Perante os compostos testados foi confirmada atividades significativas como anti-biofilme, anti-enxameação e anti-piocianina. Dos vinte e três compostos triados treze apresentaram algum tipo de interferência entre os três fenótipos avaliados, cinco com atividades antagónicas significativas contra P. aeruginosa PA14 (dois compostos mostraram redução significativa na formação de biofilme e três na produção de piocianina) e três contra o biofilme de linhagens de estafilococos, como S. aureus, Staphylococcus haemolyticus e Staphylococcus hominis. Poucos compostos interferiram no crescimento bacteriano nos microrganismos testados. Somente os compostos 04 e 09 mostraram-se bactericidas em algumas linhagens de Staphylococcus spp. e B atrophaeus. Nenhum composto interferiu com P. aeruginosa PA14. O composto 09 foi o único a apresentar atividades antagónicas nos três gêneros testados e o composto 14 mostrou-se o mais promissor perante as três análises fenotípicas avaliadas sem apresentar efeitos bactericidas. Devido ao papel fundamental nos sistemas de QS e na interação interespécie e interdomínio as AQ, bem como análogos destas moléculas, ganharam um espaço no pipeline de pesquisa e desenvolvimento de drogas antimicrobianas. Estudos anteriores demonstraram que a atividade anti-biofilme e anti-enxameação de análogos de AQ persiste após um amplo espectro de modificações das estruturas do anel de antranilato. Embora muitos trabalhos citem a resposta eficaz em moléculas com inserção ou substituição de grupos halogenados, os estudos deste trabalho revelam que a inserção nitro, corroborado por alguns trabalhos, e principalmente do grupo metil e metoxi apresentaram bons resultados invariavelmente da posição. Análises genómicas, bem como estudos polimicrobianos e avanços em estudos in vivo podem ser alvo de trabalhos futuros. Embora mais estudos necessitem ser realizados para compreensão profunda da comunicação microbiana, concluí-se que pequenas moléculas baseadas em autoindutores, tais como as AQ testadas no presente trabalho, são bioativos eficazes contra comportamentos QS dependentes e podem auxiliar no desvendamento da comunicação microbiana e seus impactos na sociedade humana.
Description
Keywords
Interspecies interactions Small molecule mimics Quorum sensing signalling molecules Bacterial communication.