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Cryopreservation of zebrafish germ cells: technological improvements and methodological standardization for gene banking and management
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 8.71 MB | Adobe PDF |
Advisor(s)
Abstract(s)
Due to the increasing number of zebrafish (Danio rerio) mutant and
transgenic lines, there is a high demand for assisted reproductive techniques to
support facility management. Efficient zebrafish sperm cryopreservation is a
pressing necessity to manage and preserve the valuable zebrafish genetic resources.
Although zebrafish sperm cryopreservation was first attempted more than 30 years
ago, protocols still lack standardization, which translates into high variability in
post-thaw sperm quality and in vitro fertilization success. Therefore, the present
thesis aims to improve the current methodologies used for zebrafish sperm
cryopreservation and broodstock management towards the standardization of
procedures in this species.
The introductory context of the present thesis is approached in chapter 1. In
this chapter the relevance of zebrafish model is discussed as well as this species
sperm cryopreservation usefulness. The main factors affecting sperm quality and
the application of reliable quality analysis are discussed in this chapter. The final
objective of sperm cryopreservation is to obtain high quality offspring and therefore
in vitro fertilization, early development and offspring quality analysis are important
tools for the optimization of sperm cryopreservation methodologies. The current
knowledge in sperm cryopreservation fundamentals is approached in this chapter,
as well as the main advances and bottlenecks in zebrafish sperm cryopreservation.
In chapter 2, the zebrafish sperm motility activation was assessed under
different conditions of water temperature and conductivity. The environmental
conditions present in the fertilization microenvironment are responsible for the
mechanism of spermatozoa motility activation and metabolic modulation that
influence the probability of fertilization success. Zebrafish is commonly reared at
28°C, but with variable water conductivity conditions among facilities. However,
sperm motility analysis is routinely performed with distilled water at room
temperature. We aimed to understand the effect of water temperature and
conductivity on sperm motility and fertilization ability. Water at 28°C with lower
water conductivity (0 and 700 μS/cm) improve sperm motility parameters.
Standardization of the water conditions (of system water and activation médium used for motility analysis) among facilities is highly relevant to improve the
reproducibility of sperm quality analysis and thus, to predict with higher accuracy
fertilization ability.
Successful cryopreservation depends on high quality sperm, which depends
on the quality of breeders. Consequently, broodstock selection and management is
a priority to improve sperm cryopreservation. The broodstock diet has a
preponderant effect on gamete quality, particularly in phospholipids and
antioxidants content which are known to promote spermatogenesis. Therefore, in
chapter 3 we aimed to determine the effects of a tailor-made purified diet
supplemented with phosphatidylcholine (PC) or phosphatidylethanolamine (PE) on
the zebrafish reproductive performance, gamete quality and larval skeletal
malformations. Both dietary supplementations with phospholipids improved sperm
motility and eggs quality, however PC increased the incidence of skeletal
malformations on the offspring, as previously observed in other teleosts. Although
dietary phospholipids classes have a role in the ossification process of the vertebral
column in teleosts, its mechanisms are still to be understood. Therefore, the
development and use of a standardized diet for zebrafish broodstock is essential to
reduce the variability of the reproductive performance among facilities. In chapter
4, the selection of optimal age and minimum sperm collection frequency was
evaluated, since these factors are essential to obtain high quality samples. Our
results indicate that young males (6-8 months) showed higher sperm quality and
require a minimum of 14 days between sperm collections to recover sperm plasma
membrane viability.
An important bottleneck in cryopreservation is the liquid nitrogen
requirement for storage. Therefore, it was established in chapter 5 a new
cryopreservation method using an electric ultrafreezer (-150°C) as an alternative to
liquid nitrogen, for the first time in a teleost species. This protocol reaches a fast
cooling rate (-66°C/min) in one single step and yields higher sperm viability and
DNA integrity in comparison to the traditional methods (-20°C/min in liquid
nitrogen). The synergy obtained by the combination of cryoprotectants is a
successful cryopreservation strategy that can be beneficial in the optimization of
zebrafish sperm cryopreservation. Therefore, it was selected the most adequate cryoprotectant combination that generates offspring with normal skeletogenesis.
Data show that 15% of DMF with 50 mM of bicine or 10% of egg yolk is beneficial
for the quality of zebrafish offspring sired by cryopreserved sperm. To the best of
our knowledge, this is the first report on skeletal development of zebrafish offspring
sired by cryopreserved sperm performed with different extender compositions.
Zebrafish is especially useful to investigate some of the most prominent
human diseases such as diabetes. Among other consequences, diabetes (type I and
II) causes disturbances in the male reproductive system, since glucose metabolism
is an important event not only in spermatogenesis but also in mature spermatozoa
metabolism. In chapter 6 we aimed to validate zebrafish as a useful model organism
to investigate male reproductive dysfunctions mechanisms caused by type I
diabetes. In this chapter, sperm cryopreservation was applied to a relevant
zebrafish model of type I diabetes. The transgenic zebrafish under diabetic
conditions shows higher levels of insulin a (insa), insulin receptor a (inra) and
glucose carrier 2 (slc2a2) transcripts in spermatozoa when compared to the
controls. This is because gametogenesis occurred under diabetic conditions,
changing transcription in the germline. Consequently, spermatozoa carry the
imprinted transcripts that will be transmitted during fertilization. Sperm quality
(motility, viability and DNA integrity) was lower in the transgenic fish under
(transient) diabetic state as observed in human and mouse model. Sperm
cryopreservation affects sperm quality of fish both under diabetic and non-diabetic
conditions. However, diabetic conditions were detrimental in sperm freezability,
which can be explained by the lower initial sperm quality. In this chapter zebrafish
was validated as a useful model organism to investigate male reproductive
dysfunctions mechanisms caused by type I diabetes.
Relevant differences between different zebrafish lines are evidenced in terms
of sperm quality and susceptibility to damage, which suggests that it is an important
factor to consider while establishing sperm cryopreservation protocols. This thesis
offers new insights and a set of guidelines on breeder’s management and sperm
cryopreservation to improve zebrafish husbandry practices.
Keywords: Zebrafish, sperm quality, cryopreservation, ultrafreezer, sperm
motility activation, diet, type I diabetes
O peixe zebra (Danio rerio) tornou-se inquestionavelmente num dos organismos modelo mais proeminentes da atualidade, devido às suas características favoráveis para investigação. O desenvolvimento de técnicas de edição genética e a sequenciação do genoma desta espécie possibilitou o desenvolvimento de milhares de linhas transgénicas e mutantes. Consequentemente, a gestão dos numerosos genótipos trouxe desafios na manutenção de espaço e gestão destes recursos genéticos. A criopreservação de sémen é uma ferramenta valiosa para a gestão destes valiosos recursos genéticos, que pode solucionar este problema. No entanto, apesar do primeiro protocolo de criopreservação de sémen de peixe zebra ter sido desenvolvido há mais de 30 anos, ainda requer otimização e estandardização. Consequentemente, existe elevada variabilidade na qualidade do sémen e sucesso da fertilização in vitro entre biotérios. O desenvolvimento de uma técnica de criopreservação de sémen eficiente é atualmente um dos maiores desafios da comunidade de peixe zebra. O objetivo principal da presente tese foi a otimização das técnicas de gestão de reprodutores e criopreservação de sémen de peixe zebra, no sentido da estandardização das práticas e maior reprodutibilidade dos resultados científicos nesta espécie. A introdução ao contexto da presente tese é abordada no capítulo 1. Neste capitulo a importância do peixe zebra como organismo modelo é abordado assim como a utilidade da criopreservação do sémen nesta espécie. Os factores que afetam a qualidade do sémen assim como a aplicação de análises de qualidade robustas são discutidos neste capítulo. O objetivo final da criopreservação de sémen é a produção de progenia com elevada qualidade. Consequentemente, neste capítulo a fertilização in vitro, o desenvolvimento emb rionário e a análise da qualidade da progenia é discutida. Neste capítulo são explorados os fundamentos de criobiologia, principais avanços e dificuldades no desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sémen de peixe zebra. As condições do ambiente de fertilização são responsáveis pela ativação da mobilidade dos espermatozóides e pela modulação do seu metabolismo, afetando consequentemente o sucesso da fertilização. O peixe zebra é estabulado a 28°C com parâmetros de condutividade da água variáveis entre biotérios. No entanto, as análises de mobilidade espermática são realizadas rotineiramente com água destilada a temperatura ambiente. Consequentemente, no capítulo 2 o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar o efeito da temperatura e condutividade da água na mobilidade de sémen de peixe zebra. Adicionalmente, foi estudado o efeito da condutividade da água no sucesso da fertilização. A água a 28°C e com baixa condutividade (0 e 700 μS/cm) melhorou os parâmetros de mobilidade. A estandardização das condições da água (dos sistemas de cultivo e do meio de ativação usado na análise da mobilidade) entre biotérios é essencial para a otimização das análises de qualidade, reprodutibilidade científica e maior precisão na estimação do potencial de sucesso de fertilização de uma amostra de sémen. O sucesso da criopreservação depende da qualidade do sémen que, por sua vez, depende da qualidade dos reprodutores. Consequentemente, a seleção e gestão de reprodutores é uma prioridade, de forma a assegurar o sucesso do método de criopreservação. Um dos factores mais importantes na gestão de reprodutores é a sua dieta. A nutrição dos reprodutores tem um importante efeito na qualidade dos gametas já que afeta a gametogénese, particularmente a composição da dieta em fosfolípidos e antioxidantes. O objetivo do capítulo 3 foi determinar o efeito de dietas purificadas suplementadas com fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE). A suplementação em fosfolípidos melhorou a mobilidade do sémen; no entanto, a suplementação em PC provocou um aumento da incidência de malformações esqueléticas na progenia. Estes resultados estão de acordo com estudos de nutrição anteriores em teleosteos. O desenvolvimento e utilização de dietas estandardizadas nos reprodutores de peixe zebra é essencial para optimizar a performance reprodutiva e reduzir a variabilidade entre biotérios. A seleção da idade ótima dos machos e a frequência mínima adequada para recolha de sémen é essencial para obter amostras com elevada qualidade. No capítulo 4 foi determinado o efeito da idade e da frequência de extração na qualidade do sémen. O nosso estudo mostrou que machos jovens (6-8 meses) de peixe zebra revelam maior qualidade de sémen e necessitam de um mínimo de 14 dias de repouso para recuperarem a viabilidade da membrana plasmática dos espermatozóides. Uma das maiores desvantagens da criopreservação é a necessidade de azoto líquido para armazenamento de amostras. Considerando esta questão, foi desenvolvido no capítulo 5 o primeiro protocolo de criopreservação de sémen de teleósteos utilizando um ultracongelador (-150°C). Este protocolo é realizado num só passo, sem a utilização de azoto líquido, sendo as amostras criopreservadas a - 66°C/min. Este protocolo melhorou a viabilidade e integridade do ADN dos espermatozóides em comparação com o método convencional (-20°C/min armazenado em azoto líquido). A combinação de diferentes crioprotetores é uma estratégia de criopreservação com elevado sucesso. Consequentemente, um dos objetivos do nosso trabalho foi selecionar a combinação de crioprotetores mais adequada para o protocolo de criopreservação estabelecido anteriormente. Os resultados deste trabalho indicam que a utilização de 15% de DMF com 50 mM de bicina ou 10% de gema de ovo produzem sémen de elevada qualidade do sémen e maior sucesso em fertilizações in vitro, assegurando também o adequado desenvolvimento esquelético da progenia. Este foi o primeiro estudo de caracterização de malformações esqueléticas desenvolvidas na progenia de peixe zebra produzido com sémen criopreservado com diferentes composições de crioprotetores. O peixe zebra é particularmente útil na investigação de doenças humanas com elevada prevalência na população mundial tal como a diabetes. Entre outras complicações geradas por esta patologia, a diabetes tipo I e II afeta o sistema reprodutor masculino. Estas perturbações ocorrem devido à alteração do metabolismo da glucose, essencial durante a espermatogénese e no metabolismo dos espermatozóides. Comparando com outros modelos, o peixe zebra tem gerações mais curtas, consequentemente seria uma ferramenta útil para esta investigação. O objetivo do capítulo 6 foi validar o peixe zebra como organismo modelo para o estudo dos mecanismos de ação da diabetes tipo I pelos quais afetam o sistema reprodutor masculino. Tal como observado em humanos e no organismo modelo de diabetes roedor, a qualidade do sémen (mobilidade, viabilidade, integridade do ADN) é reduzida na estirpe transgénica sob estado transiente de diabetes tipo I em relação ao controlo. O sémen do modelo transgénico em estado diabético revela aumento dos níveis de transcriptos de insulina a (insa), receptor de insulina a (inra) assim como de um transportador especifico de glucose GLUT 2 (slc2a2). Este facto é devido a uma alteração dos níveis de transcrição destes genes na linha germinal durante a gametogénese. O sémen criopreservado de ambos os tratamentos (controlo e diabético) revelou um decréscimo na qualidade, tal como esperado. O tratamento diabético aumentou a susceptibilidade das células à criopreservação, o que se pode dever à sua qualidade seminal inicial inferior. Assim, evidenciamos neste modelo transgénico para a diabetes tipo I os mesmos efeitos na qualidade seminal observados em humanos e em rato, validando desta forma esta linha para a investigação dos efeitos desta doença no sistema reprodutor masculino. A presente tese propõe o estabelecimento de medidas de seleção e maneio de reprodutores e análise de qualidade seminal. Adicionalmente propomos um método inovador de criopreservação de sémen, prático e económico, através do uso de um ultracongelador. Verificou-se o impacto de diferentes combinações de crioprotectores na qualidade e na esqueletogénese da progénie gerada com sémen criopreservado. Resumindo, esta tese propõe procedimentos e metodologias para a gestão de reprodutores de peixe zebra relevantes para o estabelecimento de medidas de estandardização, promovendo desta forma a reprodutibilidade de metodologias científicas.
O peixe zebra (Danio rerio) tornou-se inquestionavelmente num dos organismos modelo mais proeminentes da atualidade, devido às suas características favoráveis para investigação. O desenvolvimento de técnicas de edição genética e a sequenciação do genoma desta espécie possibilitou o desenvolvimento de milhares de linhas transgénicas e mutantes. Consequentemente, a gestão dos numerosos genótipos trouxe desafios na manutenção de espaço e gestão destes recursos genéticos. A criopreservação de sémen é uma ferramenta valiosa para a gestão destes valiosos recursos genéticos, que pode solucionar este problema. No entanto, apesar do primeiro protocolo de criopreservação de sémen de peixe zebra ter sido desenvolvido há mais de 30 anos, ainda requer otimização e estandardização. Consequentemente, existe elevada variabilidade na qualidade do sémen e sucesso da fertilização in vitro entre biotérios. O desenvolvimento de uma técnica de criopreservação de sémen eficiente é atualmente um dos maiores desafios da comunidade de peixe zebra. O objetivo principal da presente tese foi a otimização das técnicas de gestão de reprodutores e criopreservação de sémen de peixe zebra, no sentido da estandardização das práticas e maior reprodutibilidade dos resultados científicos nesta espécie. A introdução ao contexto da presente tese é abordada no capítulo 1. Neste capitulo a importância do peixe zebra como organismo modelo é abordado assim como a utilidade da criopreservação do sémen nesta espécie. Os factores que afetam a qualidade do sémen assim como a aplicação de análises de qualidade robustas são discutidos neste capítulo. O objetivo final da criopreservação de sémen é a produção de progenia com elevada qualidade. Consequentemente, neste capítulo a fertilização in vitro, o desenvolvimento emb rionário e a análise da qualidade da progenia é discutida. Neste capítulo são explorados os fundamentos de criobiologia, principais avanços e dificuldades no desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sémen de peixe zebra. As condições do ambiente de fertilização são responsáveis pela ativação da mobilidade dos espermatozóides e pela modulação do seu metabolismo, afetando consequentemente o sucesso da fertilização. O peixe zebra é estabulado a 28°C com parâmetros de condutividade da água variáveis entre biotérios. No entanto, as análises de mobilidade espermática são realizadas rotineiramente com água destilada a temperatura ambiente. Consequentemente, no capítulo 2 o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar o efeito da temperatura e condutividade da água na mobilidade de sémen de peixe zebra. Adicionalmente, foi estudado o efeito da condutividade da água no sucesso da fertilização. A água a 28°C e com baixa condutividade (0 e 700 μS/cm) melhorou os parâmetros de mobilidade. A estandardização das condições da água (dos sistemas de cultivo e do meio de ativação usado na análise da mobilidade) entre biotérios é essencial para a otimização das análises de qualidade, reprodutibilidade científica e maior precisão na estimação do potencial de sucesso de fertilização de uma amostra de sémen. O sucesso da criopreservação depende da qualidade do sémen que, por sua vez, depende da qualidade dos reprodutores. Consequentemente, a seleção e gestão de reprodutores é uma prioridade, de forma a assegurar o sucesso do método de criopreservação. Um dos factores mais importantes na gestão de reprodutores é a sua dieta. A nutrição dos reprodutores tem um importante efeito na qualidade dos gametas já que afeta a gametogénese, particularmente a composição da dieta em fosfolípidos e antioxidantes. O objetivo do capítulo 3 foi determinar o efeito de dietas purificadas suplementadas com fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE). A suplementação em fosfolípidos melhorou a mobilidade do sémen; no entanto, a suplementação em PC provocou um aumento da incidência de malformações esqueléticas na progenia. Estes resultados estão de acordo com estudos de nutrição anteriores em teleosteos. O desenvolvimento e utilização de dietas estandardizadas nos reprodutores de peixe zebra é essencial para optimizar a performance reprodutiva e reduzir a variabilidade entre biotérios. A seleção da idade ótima dos machos e a frequência mínima adequada para recolha de sémen é essencial para obter amostras com elevada qualidade. No capítulo 4 foi determinado o efeito da idade e da frequência de extração na qualidade do sémen. O nosso estudo mostrou que machos jovens (6-8 meses) de peixe zebra revelam maior qualidade de sémen e necessitam de um mínimo de 14 dias de repouso para recuperarem a viabilidade da membrana plasmática dos espermatozóides. Uma das maiores desvantagens da criopreservação é a necessidade de azoto líquido para armazenamento de amostras. Considerando esta questão, foi desenvolvido no capítulo 5 o primeiro protocolo de criopreservação de sémen de teleósteos utilizando um ultracongelador (-150°C). Este protocolo é realizado num só passo, sem a utilização de azoto líquido, sendo as amostras criopreservadas a - 66°C/min. Este protocolo melhorou a viabilidade e integridade do ADN dos espermatozóides em comparação com o método convencional (-20°C/min armazenado em azoto líquido). A combinação de diferentes crioprotetores é uma estratégia de criopreservação com elevado sucesso. Consequentemente, um dos objetivos do nosso trabalho foi selecionar a combinação de crioprotetores mais adequada para o protocolo de criopreservação estabelecido anteriormente. Os resultados deste trabalho indicam que a utilização de 15% de DMF com 50 mM de bicina ou 10% de gema de ovo produzem sémen de elevada qualidade do sémen e maior sucesso em fertilizações in vitro, assegurando também o adequado desenvolvimento esquelético da progenia. Este foi o primeiro estudo de caracterização de malformações esqueléticas desenvolvidas na progenia de peixe zebra produzido com sémen criopreservado com diferentes composições de crioprotetores. O peixe zebra é particularmente útil na investigação de doenças humanas com elevada prevalência na população mundial tal como a diabetes. Entre outras complicações geradas por esta patologia, a diabetes tipo I e II afeta o sistema reprodutor masculino. Estas perturbações ocorrem devido à alteração do metabolismo da glucose, essencial durante a espermatogénese e no metabolismo dos espermatozóides. Comparando com outros modelos, o peixe zebra tem gerações mais curtas, consequentemente seria uma ferramenta útil para esta investigação. O objetivo do capítulo 6 foi validar o peixe zebra como organismo modelo para o estudo dos mecanismos de ação da diabetes tipo I pelos quais afetam o sistema reprodutor masculino. Tal como observado em humanos e no organismo modelo de diabetes roedor, a qualidade do sémen (mobilidade, viabilidade, integridade do ADN) é reduzida na estirpe transgénica sob estado transiente de diabetes tipo I em relação ao controlo. O sémen do modelo transgénico em estado diabético revela aumento dos níveis de transcriptos de insulina a (insa), receptor de insulina a (inra) assim como de um transportador especifico de glucose GLUT 2 (slc2a2). Este facto é devido a uma alteração dos níveis de transcrição destes genes na linha germinal durante a gametogénese. O sémen criopreservado de ambos os tratamentos (controlo e diabético) revelou um decréscimo na qualidade, tal como esperado. O tratamento diabético aumentou a susceptibilidade das células à criopreservação, o que se pode dever à sua qualidade seminal inicial inferior. Assim, evidenciamos neste modelo transgénico para a diabetes tipo I os mesmos efeitos na qualidade seminal observados em humanos e em rato, validando desta forma esta linha para a investigação dos efeitos desta doença no sistema reprodutor masculino. A presente tese propõe o estabelecimento de medidas de seleção e maneio de reprodutores e análise de qualidade seminal. Adicionalmente propomos um método inovador de criopreservação de sémen, prático e económico, através do uso de um ultracongelador. Verificou-se o impacto de diferentes combinações de crioprotectores na qualidade e na esqueletogénese da progénie gerada com sémen criopreservado. Resumindo, esta tese propõe procedimentos e metodologias para a gestão de reprodutores de peixe zebra relevantes para o estabelecimento de medidas de estandardização, promovendo desta forma a reprodutibilidade de metodologias científicas.
Description
Keywords
Peixe zebra Qualidade de sémen Criopreservação Ultracongelador Activação da mobilidade de sémen Dieta Diabetes tipo I