Loading...
Publication
Molecular and cellular changes in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) skin during metamorphosis
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 10.82 MB | Adobe PDF |
Advisor(s)
Abstract(s)
Metamorphosis in vertebrates is driven by thyroid hormones (THs) and in flatfish consists in the extraordinary transformation of a symmetric pelagic larva into an asymmetric benthic juvenile. The mechanisms underlying how THs can orchestrate the cellular, morphological and functional modifications associated with maturation of juvenile/adult states in flatfish are still unexplored. The Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) was the target of the present thesis and the molecular basis of THs action was determined in the head, skin and gastrointestinal tract using RNA sequencing. The first objective of the present thesis was to generate reference transcriptomes of these three tissues using 454 pyrosequencing. Transcriptome dynamics during metamorphosis were mapped with SOLiD sequencing of whole larvae and revealed greater than 8,000 differentially expressed (DE) genes significantly up- or down-regulated in comparison with the juvenile stage. The present study contributes substantially to the molecular resources available for this species and will be an important tool for identifying new potential molecular markers for solving problems related to Atlantic halibut production during metamorphosis.
The second part of this thesis was focused in the skin due to its importance as the major barrier between the animal and its external environment and the involvement of THs in skin development during metamorphosis has been described. The present work targets the development of the primary barrier, osmoregulatory capacity and pigmentation development of Atlantic halibut skin. A multivariate approach using bioinformatics, biochemistry and molecular biology techniques allowed the characterization of the asymmetric development of H. hippoglossus ocular and abocular skin sides. The asymmetric development of skin is associated with metamorphosis although establishment of its primary barriers and osmoregulatory functional properties occurs early and is independent of metamorphosis. In addition, it was hypothesized that thyroid axis has a central role in the asymmetric pigmentation observed during metamorphosis in ocular and abocular skin sides. The third part consisted in study the cross-talk between the thyroid and cortisol axis and it was observed that both THs and cortisol act synergistically in modulating the changes in skin during halibut metamorphosis.
A metamorfose em vertebrados é um processo pós-embrionário desencadeado pelas hormonas da tiróide (THs) e em peixes-chatos (pleuronectiformes) consiste no processo de transformação da larva pelágica simétrica em juvenil bentónico assimétrico. Durante a metamorfose destes peixes teleósteos ocorre a migração de um dos olhos. No fim do processo metamórfico os olhos ficam no mesmo lado da cabeça e a pigmentação acentua-se apenas no lado ocular. A importância das THs durante a metamorfose nos “peixes-chatos” tem sido demonstrada ao longo dos últimos anos, no entanto, o papel destas hormonas durante as modificações celulares, morfológicas e funcionais associadas à maturação dos peixes juvenis/adultos é pouco claro. Após entrar nas células a partir de transportadores específicos (por exemplo os “monocarboxylate transporters”, MCTs) e se ligarem a receptores nucleares (TRs), as THs activam a expressão génica e por sua vez induzem mudanças na estrutura, maturação e função dos tecidos e órgãos. A forma biologicamente activa é a T3 e é originada nos tecidos periféricos pela conversão da T4 através da acção de enzimas específicas chamadas de deiodinases, que podem também inactivar as THs. Assim, como as THs actuam na transcrição de genes responsivos, definiu-se que uma das principais hipóteses deste trabalho é que a maturação dos tecidos durante a metamorfose deve ser precedida a modificações significativas no transcriptoma. O alabote do Atlântico (Hippoglossus hippoglossus) foi escolhido como modelo de estudo devido à sua importância para a aquacultura mas principalmente devido ao seu lento desenvolvimento larvar (metamorfose dura aproximadamente 58 dias) e ao tamanho das larvas (aproximadamente 14.50-23.00 mm início e fim da metamorfose). Estas características permitiram não só analisar larvas individuais mas também dissecar tecidos e analisá-los em separado a nível molecular. O primeiro objectivo do presente trabalho foi determinar a base molecular da acção das THs através da sequenciação do transcriptoma por RNAseq de três tecidos (cabeça, pele e trato gastrointestinal – trato GI) durante a metamorfose de H. hippoglossus (Capítulo 2). Três diferentes transcriptomas de referência foram gerados utilizando a técnica de pirosequenciação 454 e após a “assembly” foram obtidos 90.676 (cabeça), 65.530 (pele) e 38.426 (tracto GI) contigs. Através de uma abordagem de múltiplos passos de Blast, mais de 57 % dos contigs foram anotados com sucesso, permitindo assim identificar para cada tecido um conjunto de processos biológicos e genes candidatos associados às alterações morfológicas e funcionais durante a metamorfose. Posteriormente, a dinâmica do transcriptoma durante a metamorfose foi avaliada através da sequenciação de larvas individuais (n = 3) de vários estados metamórficos. A abordagem utilizada foi uma sequenciação do tipo SOLiD, e após o mapeamento das sequências “reads” contra o transcriptoma de referencia foi possível detectar mais de 8.000 genes diferencialmente expressos, sobre- ou sub-expressos ao comparar os estados metamórficos com o juvenil. A maioria dos genes diferencialmente expressos não são responsivos às THs. Utilizando uma base de dados “in house” foram identificados seis grupos (clusters) diferentes de genes responsivos baseados no seu padrão de expressão durante a metamorfose. A maioria dos 145 genes responsivos às hormonas da tiróide encontram-se sub-expressos quando comparados com o juvenil após a metamorfose. Estes genes responsivos estão associados a diferentes “gene networks”, cascatas de sinalização “signalling cascades” e factores de transcrição que devem liderar as alterações no desenvolvimento e maturação dos tecidos durante a metamorfose. Durante a análise do transcriptoma foram identificados dois transcriptos diferentes que correspndem à deiodinase 3 (Dio3). A Dio3 é uma enzima que desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento dos vertebrados, através do controlo da disponibilidade das THs nos vários tecidos. O segundo objectivo da presente tese foi avaliar qual é o papel destes dois transcriptos dio3 durante a metamorfose do alabote do Atlântico (Capítulo 3). Análises bioinformáticas permitiram concluir que estes dois transcriptos correspondem a genes duplicados (posteriormente designados de dio3a e dio3b) e que é comum à maioria dos peixes teleósteos. A expressão destes dois genes na pele foi divergente entre os lados ocular e não-ocular durante a metamorfose. Os resultados obtidos da expressão génica indicaram que o gene dio3b pode estar associado à maturação divergente dos dois lados da pele. Larvas expostas ao bloqueador de produção de THs, o MMI, resultou numa sobre-expressão de dio3b no lado ocular da pele, sugerindo que as THs geralmente inibem a expressão deste gene durante esta fase do desenvolvimento. Os resultados indicam que a expressão divergente de dio3 nos lados ocular e não-ocular da pele durante a metamorfose pode contribuir para o desenvolvimento assimétrico em resposta às THs. A pele nos vertebrados é um órgão multifuncional e corresponde à principal barreira entre o animal e o seu meio ambiente. Durante a metamorfose, a pele do Hippoglossus hippoglossus muda de um simples epitélio para um tecido composto estratificado em várias camadas após a metamorfose. A epiderme fica composta por vários tipos de células com diferentes funções e a disponibilidade das THs na pele durante a metamorfose é regulada pela acção coordenada das deiodinases. Por estas razões a pele representa um interessante alvo de estudo para a acção das THs durante a metamorfose. Os capítulos 4 e 5 foram dirigidos à pele em especial às suas funções como barreira primária, osmoregulação e pigmentação, e a sua possível relação com as hormonas da tiróide durante a metamorfose do alabote do Atlântico. A combinação de técnicas de histologia, histoquímica e electrofisiologia permitiu estudar as funções de barreira e osmorregulação da pele, através da análise ontogénica das células goblet (secreção de mucinas) e dos ionócitos (presença da Na+,K+-ATPase) na pele ocular e não-ocular (Capítulo 4). A integridade do epitélio e as propriedades electrofisiológicas foram avaliadas por electrofisiologia na pele no lado ocular. As mucinas neutras são as principais glicoproteínas produzidas pelas células goblet da pele durante a metamorfose, e a sua abundância aumenta durante o processo metamórfico. Nos estágios metamórficos 8 a 9B estas células bem como o número de mucinas é mais abundante no lado ocular da pele. Este aumento e a sua abundância assimétrica entre os dois lados da pele é concomitante com o aumento das THs, sugerindo-se que o seu desenvolvimento encontra-se sob o controlo destas hormonas. Ao contrário das goblet cells (mucinas), o número de ionócitos com imunoreactividade positiva para a Na+,K+-ATPase (NKA) decresce ao longo da metamorfose e a distribuição é simétrica entre os dois lados da pele. As alterações morfológicas observadas têm um efeito demonstrado na função de barreira da pele tal como reflectido pelas propriedades electrofisiológicas do epitélio (resistência transepitelial/potencial e “short circuit current”). No entanto, a maturação das características funcionais ocorreu no estágio 8, antes da maturação completa da pele e do clímax da metamorfose. Estes resultados indicam estudo que há um desenvolvimento assimétrico da pele e que este está associado com a metamorfose. No entanto, o estabelecimento das suas propriedades funcionais ocorre cedo e é independente da metamorfose. No capítulo 5 foi utilizada uma abordagem molecular para avaliar a resposta assimétrica dos dois lados da pele às THs e sua relação com a pigmentação. Neste estudo, foi avaliada a expressão de genes relacionados com o transporte, metabolismo e acção das THs, e de genes envolvidos na melanogénese e na regulação da pigmentação na pele ocular e não-ocular durante a metamorfose do alabote do Atlântico. Foi também avaliada o possivel “cross-talk” entre os eixos da tiróide e stress durante a maturação da pele e pigmentação. A expressão dos receptores da tiróide e deiodinases (dio1, dio2, dio3a, dio3b, trαa and trβ) foi simétrica entre os lados ocular e não-ocular da pele. No entanto, a expressão dos transportadores das THs (mct8, mct10) foi assimétrica nos dois lados da pele durante a metamorfose. Genes envolvidos na melanogénese (tyrp1, dct) e regulação da pigmentação (sox10) tiveram uma expressão semelhante aos transportadores das THs. Este estudo contribui para uma melhor compreensão das bases moleculares da assimetria na pigmentação observada durante a metamorfose do alabote do Atlântico, e revela um papel central para o eixo da tiróide. A hipótese da existência de um “cross talk” entre o eixo da tiróide e do cortisol durante a metamorfose onde as THs e o cortisol actuam de forma sinergética na modulação das alterações na pele durante a metamorfose do alabote do Atlântico foi demonstrada neste capítulo. A presente tese permitiu gerar novo conhecimento sobre os efeitos das THs no desenvolvimento dos “peixes chatos” em especial na cabeça, pele e trato gastrointestinal. Esta tese contribuiu também para entender melhor acerca do desenvolvimento assimétrico dos lados ocular e não-ocular da pele e como as THs se encontram envolvida neste processo.
A metamorfose em vertebrados é um processo pós-embrionário desencadeado pelas hormonas da tiróide (THs) e em peixes-chatos (pleuronectiformes) consiste no processo de transformação da larva pelágica simétrica em juvenil bentónico assimétrico. Durante a metamorfose destes peixes teleósteos ocorre a migração de um dos olhos. No fim do processo metamórfico os olhos ficam no mesmo lado da cabeça e a pigmentação acentua-se apenas no lado ocular. A importância das THs durante a metamorfose nos “peixes-chatos” tem sido demonstrada ao longo dos últimos anos, no entanto, o papel destas hormonas durante as modificações celulares, morfológicas e funcionais associadas à maturação dos peixes juvenis/adultos é pouco claro. Após entrar nas células a partir de transportadores específicos (por exemplo os “monocarboxylate transporters”, MCTs) e se ligarem a receptores nucleares (TRs), as THs activam a expressão génica e por sua vez induzem mudanças na estrutura, maturação e função dos tecidos e órgãos. A forma biologicamente activa é a T3 e é originada nos tecidos periféricos pela conversão da T4 através da acção de enzimas específicas chamadas de deiodinases, que podem também inactivar as THs. Assim, como as THs actuam na transcrição de genes responsivos, definiu-se que uma das principais hipóteses deste trabalho é que a maturação dos tecidos durante a metamorfose deve ser precedida a modificações significativas no transcriptoma. O alabote do Atlântico (Hippoglossus hippoglossus) foi escolhido como modelo de estudo devido à sua importância para a aquacultura mas principalmente devido ao seu lento desenvolvimento larvar (metamorfose dura aproximadamente 58 dias) e ao tamanho das larvas (aproximadamente 14.50-23.00 mm início e fim da metamorfose). Estas características permitiram não só analisar larvas individuais mas também dissecar tecidos e analisá-los em separado a nível molecular. O primeiro objectivo do presente trabalho foi determinar a base molecular da acção das THs através da sequenciação do transcriptoma por RNAseq de três tecidos (cabeça, pele e trato gastrointestinal – trato GI) durante a metamorfose de H. hippoglossus (Capítulo 2). Três diferentes transcriptomas de referência foram gerados utilizando a técnica de pirosequenciação 454 e após a “assembly” foram obtidos 90.676 (cabeça), 65.530 (pele) e 38.426 (tracto GI) contigs. Através de uma abordagem de múltiplos passos de Blast, mais de 57 % dos contigs foram anotados com sucesso, permitindo assim identificar para cada tecido um conjunto de processos biológicos e genes candidatos associados às alterações morfológicas e funcionais durante a metamorfose. Posteriormente, a dinâmica do transcriptoma durante a metamorfose foi avaliada através da sequenciação de larvas individuais (n = 3) de vários estados metamórficos. A abordagem utilizada foi uma sequenciação do tipo SOLiD, e após o mapeamento das sequências “reads” contra o transcriptoma de referencia foi possível detectar mais de 8.000 genes diferencialmente expressos, sobre- ou sub-expressos ao comparar os estados metamórficos com o juvenil. A maioria dos genes diferencialmente expressos não são responsivos às THs. Utilizando uma base de dados “in house” foram identificados seis grupos (clusters) diferentes de genes responsivos baseados no seu padrão de expressão durante a metamorfose. A maioria dos 145 genes responsivos às hormonas da tiróide encontram-se sub-expressos quando comparados com o juvenil após a metamorfose. Estes genes responsivos estão associados a diferentes “gene networks”, cascatas de sinalização “signalling cascades” e factores de transcrição que devem liderar as alterações no desenvolvimento e maturação dos tecidos durante a metamorfose. Durante a análise do transcriptoma foram identificados dois transcriptos diferentes que correspndem à deiodinase 3 (Dio3). A Dio3 é uma enzima que desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento dos vertebrados, através do controlo da disponibilidade das THs nos vários tecidos. O segundo objectivo da presente tese foi avaliar qual é o papel destes dois transcriptos dio3 durante a metamorfose do alabote do Atlântico (Capítulo 3). Análises bioinformáticas permitiram concluir que estes dois transcriptos correspondem a genes duplicados (posteriormente designados de dio3a e dio3b) e que é comum à maioria dos peixes teleósteos. A expressão destes dois genes na pele foi divergente entre os lados ocular e não-ocular durante a metamorfose. Os resultados obtidos da expressão génica indicaram que o gene dio3b pode estar associado à maturação divergente dos dois lados da pele. Larvas expostas ao bloqueador de produção de THs, o MMI, resultou numa sobre-expressão de dio3b no lado ocular da pele, sugerindo que as THs geralmente inibem a expressão deste gene durante esta fase do desenvolvimento. Os resultados indicam que a expressão divergente de dio3 nos lados ocular e não-ocular da pele durante a metamorfose pode contribuir para o desenvolvimento assimétrico em resposta às THs. A pele nos vertebrados é um órgão multifuncional e corresponde à principal barreira entre o animal e o seu meio ambiente. Durante a metamorfose, a pele do Hippoglossus hippoglossus muda de um simples epitélio para um tecido composto estratificado em várias camadas após a metamorfose. A epiderme fica composta por vários tipos de células com diferentes funções e a disponibilidade das THs na pele durante a metamorfose é regulada pela acção coordenada das deiodinases. Por estas razões a pele representa um interessante alvo de estudo para a acção das THs durante a metamorfose. Os capítulos 4 e 5 foram dirigidos à pele em especial às suas funções como barreira primária, osmoregulação e pigmentação, e a sua possível relação com as hormonas da tiróide durante a metamorfose do alabote do Atlântico. A combinação de técnicas de histologia, histoquímica e electrofisiologia permitiu estudar as funções de barreira e osmorregulação da pele, através da análise ontogénica das células goblet (secreção de mucinas) e dos ionócitos (presença da Na+,K+-ATPase) na pele ocular e não-ocular (Capítulo 4). A integridade do epitélio e as propriedades electrofisiológicas foram avaliadas por electrofisiologia na pele no lado ocular. As mucinas neutras são as principais glicoproteínas produzidas pelas células goblet da pele durante a metamorfose, e a sua abundância aumenta durante o processo metamórfico. Nos estágios metamórficos 8 a 9B estas células bem como o número de mucinas é mais abundante no lado ocular da pele. Este aumento e a sua abundância assimétrica entre os dois lados da pele é concomitante com o aumento das THs, sugerindo-se que o seu desenvolvimento encontra-se sob o controlo destas hormonas. Ao contrário das goblet cells (mucinas), o número de ionócitos com imunoreactividade positiva para a Na+,K+-ATPase (NKA) decresce ao longo da metamorfose e a distribuição é simétrica entre os dois lados da pele. As alterações morfológicas observadas têm um efeito demonstrado na função de barreira da pele tal como reflectido pelas propriedades electrofisiológicas do epitélio (resistência transepitelial/potencial e “short circuit current”). No entanto, a maturação das características funcionais ocorreu no estágio 8, antes da maturação completa da pele e do clímax da metamorfose. Estes resultados indicam estudo que há um desenvolvimento assimétrico da pele e que este está associado com a metamorfose. No entanto, o estabelecimento das suas propriedades funcionais ocorre cedo e é independente da metamorfose. No capítulo 5 foi utilizada uma abordagem molecular para avaliar a resposta assimétrica dos dois lados da pele às THs e sua relação com a pigmentação. Neste estudo, foi avaliada a expressão de genes relacionados com o transporte, metabolismo e acção das THs, e de genes envolvidos na melanogénese e na regulação da pigmentação na pele ocular e não-ocular durante a metamorfose do alabote do Atlântico. Foi também avaliada o possivel “cross-talk” entre os eixos da tiróide e stress durante a maturação da pele e pigmentação. A expressão dos receptores da tiróide e deiodinases (dio1, dio2, dio3a, dio3b, trαa and trβ) foi simétrica entre os lados ocular e não-ocular da pele. No entanto, a expressão dos transportadores das THs (mct8, mct10) foi assimétrica nos dois lados da pele durante a metamorfose. Genes envolvidos na melanogénese (tyrp1, dct) e regulação da pigmentação (sox10) tiveram uma expressão semelhante aos transportadores das THs. Este estudo contribui para uma melhor compreensão das bases moleculares da assimetria na pigmentação observada durante a metamorfose do alabote do Atlântico, e revela um papel central para o eixo da tiróide. A hipótese da existência de um “cross talk” entre o eixo da tiróide e do cortisol durante a metamorfose onde as THs e o cortisol actuam de forma sinergética na modulação das alterações na pele durante a metamorfose do alabote do Atlântico foi demonstrada neste capítulo. A presente tese permitiu gerar novo conhecimento sobre os efeitos das THs no desenvolvimento dos “peixes chatos” em especial na cabeça, pele e trato gastrointestinal. Esta tese contribuiu também para entender melhor acerca do desenvolvimento assimétrico dos lados ocular e não-ocular da pele e como as THs se encontram envolvida neste processo.
Description
Keywords
Flatfish Metamorphosis Thyroid hormones Transcriptome Skin development Asymmetry