Publication
Design, synthesis and in vitro evaluation of a series of endoperoxide hybrids designed to tackle latent tuberculosis
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias | |
| dc.contributor.advisor | Cristiano, Maria de Lurdes dos Santos | |
| dc.contributor.advisor | O’Neill, Paul Michael | |
| dc.contributor.author | Amado, Patrícia Sofia Menalha | |
| dc.date.accessioned | 2024-07-19T10:57:37Z | |
| dc.date.available | 2024-07-19T10:57:37Z | |
| dc.date.issued | 2023-07-11 | |
| dc.description.abstract | Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the world's second leading cause of death from infectious diseases (after COVID-19). The ability of Mtb to enter the nonreplicating persistence (NRP) and then transition to latent TB contributes to Mtb's drug tolerance and treatment failure in chronically infected individuals. The DosRST two-component regulatory system regulates the Mtb physiology to promote NRP, in which peroxides such as the natural antimalarial drug artemisinin and synthetic 1,2,4-trioxolanes have been demonstrated to inhibit this system and re-sensitize Mtb. Hence, we proposed hybridizing two separate anti-TB classes by combining the 1,2,4-trioxane-containing moieties with the indole-2-carboxamide scaffold (MmpL3 inhibitors) and the benzothiazinone scaffold (DprE1 inhibitors), to establish a dual mode of action, by increasing Mtb's sensitivity to the active anti-TB pharmacophore while also targeting the DosRST signalling. These hybrid compounds prepared were evaluated for their in vitro antimycobacterial activity, and the drug metabolism and pharmacokinetics parameters were also assessed. Additionally, we evaluated ~1519 DprE1 inhibitors disclosed in the literature from 2009-2022 by performing an in-depth analysis of physicochemical descriptors and absorption, distribution, metabolism, elimination, and toxicology properties to deepen our understanding of DprE1 inhibitors and build machine learning classification models. | eng |
| dc.description.abstract | A infeção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é, atualmente, a segunda principal causa de morte no mundo por doenças infeciosas, estando apenas atrás da COVID-19. Acredita-se que um quarto da população mundial esteja infetado por esta micobactéria e a forma mais prevalente é a tuberculose pulmonar, altamente contagiosa e potencialmente fatal se não tratada. A capacidade da Mtb de entrar no estado não replicativo (NRP) e, em seguida, transitar para a tuberculose latente, contribui para a tolerância/resistência da micobactéria relativamente à terapêutica, levando à falha no tratamento em indivíduos cronicamente infetados. Desta forma, melhorias de tratamento contra a tuberculose (TB) requerem moléculas de ação mais rápida e capaz de contornar o problema da latência. O sistema regulador de dois componentes DosRST, composto por um gene regulador transcricional, DosR, e duas histidinas quinases, DosS e DosT, regula a fisiologia da Mtb para promover o estado não replicativo, o qual é induzido por hipoxia, monóxido de carbono e óxido nítrico no meio celular. Foi publicado que o antimalárico artemisinina (ART), um 1,2,4-trioxano de origem natural, participa na desregulação das proteínas dependentes do sistema DosRST. Essa inibição foi atribuída à capacidade da ligação peroxídica presente na estrutura 1,2,4-trioxano da ART de interagir com o grupo heme em DosS e DosT, levando à sua inativação. O pré-tratamento com ART aumenta assim a sensibilidade da Mtb latente à isoniazida, um medicamento anti-TB de primeira linha, mas sem atividade antimicrobiana contra a Mtb latente. Foi também descoberto em 2022 que os peróxidos sintéticos 1,2,4-trioxolano OZ277 e OZ439 podem direcionar a sinalização de hipoxia mediada por DosS em M. abscessus e reproduzir o fenótipo “knock-out” de DosS, aumentando a sensibilidade da Mtb à antibioterapia. Como os compostos ART, OZ277 e OZ439 demonstraram inibir essas histidina-quinases, postulou-se que outros endoperóxidos sintéticos também poderiam interagir com DosS e DosT. A procura de novas moléculas com dupla ação, capazes de interromper a sinalização de DosRST e, ao mesmo tempo, inibir uma proteína-alvo de Mtb conhecida, afigura-se como uma estratégia de tratamento válida para travar a Mtb latente. Desta forma, foi proposto hibridizar duas classes de compostos com propriedades anti-TB, através da combinação de um fragmento que contém um endoperóxido com um fragmento indole-2-carboxamida (que inibe a proteína transportadora MmpL3), ou com um fragmento de benzotiazinona (que inibe a flavoenzima DprE1). O tipo de endoperóxido escolhido para esta tese foi o endoperóxido cíclico 1,2,4-trioxano. Com esta abordagem híbrida, procurou-se estabelecer um modo de ação duplo, aumentando a sensibilidade da Mtb ao farmacóforo anti-TB e, ao mesmo tempo, alterar a sinalização do sistema DosRST. Os estudos realizados nesta tese concentram-se no desenho, síntese, estrutura e propriedades de uma biblioteca de novos híbridos de 1,2,4-trioxano, com o fragmento indole-2-carboxamida (IC) e com o fragmento benzotiazinona (BTZ). Esses compostos híbridos foram avaliados quanto à sua atividade antituberculosa in vitro, e os seus parâmetros farmacocinéticos e metabolismo (DMPK) foram também avaliados. A análise dos híbridos de peróxido-IC contra Mtb no estado replicativo (forma ativa) demonstrou baixa atividade para a maioria dos compostos (IC50 > 10 μM), embora o metabolito controlo 2.84 e o híbrido tetraoxano 2.86 tenham exibido atividade inibitória moderada no crescimento de Mtb (IC50 = 5,680 e 2,634 μM, respetivamente). Os estudos de modelação molecular explicam a baixa atividade dos híbridos peróxido-IC, uma vez que os resultados obtidos foram pouco satisfatórios para estes compostos, exceto para o análogo IC dimetilado, TIC01. No entanto, verificou-se que este híbrido de peróxido também não era ativo contra o Mtb. Em contrapartida, a síntese dos análogos peróxidos-BTZ resultou em dezasseis novos compostos de híbridos peróxidos-BTZ e levou à identificação de compostos ativos potentes, com valores de IC50 na escala nanomolar (1,32-870 nΜ) e picomolar (< 0,457 nM). Os estudos de modelação molecular demonstraram boa sobreposição entre o sistema de anéis BTZ dos híbridos e o ligando de referência (BTZ043), o que justifica a potente atividade submicromolar observada nessas séries. Foram efetuados estudos in silico para os híbridos endoperoxídicos sintetizados e os dados obtidos foram comparados com os resultados in vitro de DMPK. Experimentalmente, os híbridos IC-trioxano TIC01-03 apresentam lipofilicidades similares e solubilidades baixas a pH 7,4, como previsto para os compostos indole-2-carboxamida. Os perfis metabólicos dos híbridos peróxido-IC e peróxido-BTZ043 apresentaram valores de moderado a bom, enquanto para os híbridos peróxido-PBTZ169 foram de fraco a moderado. Os elevados valores de cLogP obtidos para todos os compostos sintetizados explicam a baixa solubilidade aquosa destas moléculas. Estudos in vivo dos perfis farmacocinéticos dos híbridos peróxido-BTZ B3, P1 e dos compostos controlo indicam que os híbridos endoperóxido-BTZ são metabolicamente menos estáveis do que os correspondentes BTZs. Isto deve-se, possivelmente, à ligação lábil do peróxido na sua estrutura, o que os torna mais suscetíveis ao metabolismo. Comparando com os compostos líder (BTZ043 e PBTZ169), o peróxido-BTZ B3 exibiu dados farmacocinéticos semelhantes. Os compostos mais promissores da série endoperóxido-BTZ foram selecionados para avaliação em células Mtb modificadas para expressar proteína verde fluorescente (“green fluorescent protein”, GFP) dependente de DosRST, de forma a avaliar a inibição neste sistema. Estes ensaios celulares encontram-se em avaliação. A vulnerabilidade não específica da flavoenzima DprE1 pode explicar os resultados promissores obtidos durante o desenvolvimento de híbridos endoperóxido-BTZ. Embora o desenvolvimento de inibidores de DprE1 possa ser complexo, aprofundar a compreensão das suas propriedades físico-químicos (FQ) e características relacionadas com a absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET) pode facilitar a descoberta de novos compostos potentes. Com este objetivo em mente foi realizada uma extensa análise dos descritores FQ e dos parâmetros ADMET para aprofundar os conhecimentos acerca dos inibidores de DprE1. Foram avaliadas 1519 moléculas classificadas como inibidores da enzima DprE1, com cobertura da literatura disponível desde 2009 até abril de 2022. Concomitantemente, foram construídos modelos de classificação para os inibidores DprE1, de forma a possibilitar a previsão da atividade de um composto através da análise das suas propriedades químicas. Para além da utilização no tratamento do Mtb, os peróxidos orgânicos, em especial os 1,2,4-trioxanos e os 1,2,4,5-tetraoxanos, em que a funcionalidade peróxido está inserida em anéis de seis membros, têm despertado grande interesse na química medicinal devido ao seu potencial para o tratamento de outras doenças, nomeadamente a malária. Uma parte dos estudos realizados no âmbito desta tese concentrou-se em melhorar os métodos de síntese de peróxidos de seis membros para expandir as bibliotecas destes compostos, facilitando a descoberta de novos candidatos a fármacos. Foi investigada a ciclocondensação de um conjunto de cetonas com gem-dihidroperóxidos ou álcoois peroxisilílicos/β-hidroperoxiálcoois para produzir os correspondentes 1,2,4,5-tetraoxanos ou 1,2,4-trioxanos assimétricos, mediada pelo catalisador SSA. Os catalisadores suportados em sílica têm atraído a atenção recentemente devido à sua promissora reatividade, sendo também recicláveis e reutilizáveis, com grandes vantagens económicas e ambientais. As etapas elementares envolvidas na via de ciclocondensação foram investigadas através de cálculos de orbitais moleculares, usando a teoria do funcional de densidade (DFT), no nível de aproximação ωB97XD/def2-TZVPP/PCM(DCM)//B3LYP/6-31G(d). Os resultados sustentam uma proposta mecanística que destaca a função catalítica da SSA, onde a protonação inicial do grupo carbonilo da cetona pela SSA surge como uma etapa chave no mecanismo. Esta nova abordagem envolvendo o catalisador suportado em sílica oferece várias vantagens sintéticas, nomeadamente a tolerância a uma ampla gama de substratos. Além disso, a fácil preparação, reciclabilidade e propriedades ecológicas do catalisador SSA são características que tornam este método uma ferramenta atraente para desenvolver novos endoperóxidos biologicamente ativos, estabelecendo assim uma abordagem válida para a síntese de novos endoperóxidos biologicamente ativos sem recurso a catalisadores baseados em metais tóxicos. Apesar das potenciais aplicações terapêuticas dos endoperóxidos, os estudos fundamentais sobre as estruturas dos 1,2,4-trioxolanos e 1,2,4,5-tetraoxanos são escassos. Neste âmbito, combinando a cristalografia de raios-X e a espectroscopia vibracional com a análise de superfície de Hirshfeld e cálculos (CE-B3LYP/6-31G(d,p)) das energias de interação par a par dos contatos intermoleculares existentes na estrutura cristalina, foi possível aprofundar o conhecimento estrutural, o que facilita a compreensão da reatividade relativa e das propriedades dessas classes de endoperóxidos. | por |
| dc.description.sponsorship | I also thank the Department of Chemistry (University of Liverpool) and CCMAR (with the operational programs CRESC Algarve 2020 and COMPETE 2020 through projects EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121, UIDB/04326/2020, UIDP/04326/2020, and LA/P/0101/2020) for providing facilities for compounds characterization, namely mass spectrometry, NMR, and elemental analysis. | |
| dc.identifier.tid | 101761520 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/25677 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.relation | A Chemical Proteomics Approach to Defining the Mechanism of Artemisinin Action and Resistance in PfK13 Resistant parasites | |
| dc.relation | A Chemical Proteomics Approach to Defining the Mechanism of Artemisinin Action and Resistance in PfK13 Resistant parasites | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Tuberculose | |
| dc.subject | Endoperóxidos | |
| dc.subject | Híbridos antituberculares | |
| dc.subject | Inibidores de dosrst | |
| dc.subject | Catalisadores suportados em sílica | |
| dc.title | Design, synthesis and in vitro evaluation of a series of endoperoxide hybrids designed to tackle latent tuberculosis | por |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardTitle | A Chemical Proteomics Approach to Defining the Mechanism of Artemisinin Action and Resistance in PfK13 Resistant parasites | |
| oaire.awardTitle | A Chemical Proteomics Approach to Defining the Mechanism of Artemisinin Action and Resistance in PfK13 Resistant parasites | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT//SFRH%2FBD%2F130407%2F2017/PT | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT//COVID%2FBD%2F152392%2F2022/PT | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| relation.isProjectOfPublication | 5358320e-020a-450c-b91e-969453711e3f | |
| relation.isProjectOfPublication | 2c67f8b8-1679-4b90-aeef-b4973d5886f1 | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | 5358320e-020a-450c-b91e-969453711e3f | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Doutor | |
| thesis.degree.name | Doutoramento em Quimica |