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Publication
Fish as a model to assess the effects of Thalidomide on limb development
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Authors
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Abstract(s)
Thalidomide was an anti-emetic non-toxic sedative prescribed for morning sickness during late 50s, until its teratogenicity was revealed with more than 10,000 children affected by thalidomide embryopathy. Thalidomide molecular mechanisms have remained elusive for many years until Cereblon was identified the main target of thalidomide, promoting the degradation of key transcription factors involved in embryogenesis. We aimed to use zebrafish as a biological model to understand molecular events associated with thalidomide embryopathies and identify how bone metabolism could be affected.
To optimize the thalidomide exposure methodology a series of in vivo experiments were done aiming to improve zebrafish embryo dechorionation, effective thalidomide concentrations and time window of exposure. The impact of thalidomide was evaluated by analyzing pectoral fin deformities in zebrafish larvae at 4 days post-fertilization using alcian blue staining and gene expression analysis by qPCR. Furthermore, to understand thalidomide effects on bone metabolism, in vitro assays were performed in VSa13, Sparus aurata vertebra derived cell line of progenitor osteo-chondrocytes within a context of cell differentiation and mineralization.
Thalidomide exposure from 2 hours post-fertilization after 5 minutes treatment with 0.05 mg/mL pronase, leads to the phenotype of interest and 600μM was the most effective concentration on pectoral fin length shortening. Gene expression confirmed thalidomide embryotoxicity through downregulation of sall4 and sox9a transcription factors. Additionally, a downregulation of col1a1 and upregulation of spp1 suggest an impact on bone metabolism. In vitro experiments corroborated that thalidomide inhibited mineralization, possibly by blocking terminal differentiation attending to the downregulation of sp7 transcription factor. The anti-angiogenic properties of thalidomide may also contribute to limb malformations, and the results revealed upregulation of vegfaa mRNAs and FLI1 protein. We conclude that thalidomide molecular action is complex, and limb malformations could result from a combination between angiogenesis deregulation and impairment of key regulators of chondrogenesis and bone metabolism.
Em 1957, o sedativo antiemético talidomida foi disseminado como não tóxico e prescrito maioritariamente durante as primeiras 3 semanas de gravidez no alívio dos enjoos matinais durante 4 anos, até que inúmeros abortos e mais de 10.000 crianças foram declaradas afetadas pelo seu efeito teratogénico. Foram observadas várias anomalias congénitas graves em bebés nascidos após as mães terem sido tratadas com talidomida, apresentando deformações em quase todos os tecidos e órgãos possivelmente afetados e uma ampla variabilidade na gravidade de malformações nos membros, olhos, ouvidos, coração, rins, trato gastrointestinal, medula espinal, face/ palato e genitais. No entanto, estudos farmacológicos e moleculares contínuos num esforço para descobrir os efeitos teratogénicos da talidomida levaram à descoberta da sua eficiência contra doenças autoimunes, inibição da produção do factor de transcrição de necrose tumoral (TNF)-alfa e atividade anti-angiogénica (anticancerígena). Estas capacidades levaram à sua aprovação pela FDA e impulsionaram este medicamento tal como os seus derivados a serem prescritos como potentes medicamentos imunomoduladores (IMiDs) no tratamento de uma gama de condições médicas sob devido acompanhamento e supervisão. Os mecanismos moleculares da talidomida permaneceram elusivos durante muitos anos, até que, recentemente, a cereblon (CRBN) foi identificada como o principal alvo da talidomida. Esta proteína funciona como uma subunidade de um complexo de ubiquitina E3 ligase com a DDB1 (Proteína de Ligação ao DNA 1) cuja atividade depende dos substratos que a ele se ligam e, quando complexada com a talidomida, pode promover a degradação de fatores de transcrição-chave envolvidos na embriogénese originando, consequentemente, malformações embrionárias. Algumas das hipóteses propostas para explicar a embriogénese da talidomida envolvem vários mecanismos nomeadamente: Inibição da angiogénese (a talidomida interfere na formação de novos vasos sanguíneos e a sua ramificação), alteração na sinalização celular (afetando vias de sinalização importantes para o desenvolvimento, tal como a via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)), apoptose celular (afetando a morfologia e formação de estruturas embrionárias), desregulação da expressão de fatores de transcrição essenciais à formação dos membros anteriores e outras estruturas anatómicas originando deformações e efeitos imunomoduladores que impactam o desenvolvimento embrionário. O desastre da talidomida levantou questões cruciais sobre a segurança dos medicamentos e a necessidade de avaliações mais abrangentes durante o desenvolvimento farmacêutico. A falta de previsibilidade nos efeitos adversos em humanos, em contraste com os resultados em roedores, evidenciou a importância de se considerar a variabilidade entre espécies ao testar novas drogas, destacando a importância de um rigoroso processo de triagem para a prescrição deste medicamento. Estudos demonstraram que roedores não são suscetíveis aos efeitos teratogénicos e terapêuticos da talidomida e dos seus derivados, devido a diferenças em determinados aminoácidos que inibem a ligação da talidomida ao seu alvo primário: o CEREBLON. Em resposta à variada suscetibilidade de diferentes espécies aos danos causados pela talidomida, que se identificaram através de análises comparativas fenotípicas e genómicas, no presente, novos medicamentos candidatos são testados em pelo menos duas espécies animais (sendo uma delas não roedor) antes de serem submetidos a testes clínicos. O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal cujo uso em estudos fármaco-toxicológicos tem aumentado para o estudo de distúrbios esqueléticos humanos, uma vez que os processos de ossificação e homeostase apresentam várias semelhanças anatómicas e genéticas, e porque o seu ciclo de vida curto, elevado número de descendentes e a sua transparência (permitindo a observação direta do desenvolvimento e avaliação de processos biológicos em tempo real) são vantajosos para estudos embrionários e de desenvolvimento. Além disso, demonstrou ser suscetível aos efeitos anti-angiogénicos da talidomida e, possivelmente, a outros danos teratogénicos. Com este estudo, pretendemos usar o peixe-zebra como modelo biológico para entender os eventos moleculares associados às embriopatias causadas pela talidomida e identificar de que forma o metabolismo ósseo pode ser afetado. Para otimizar a metodologia de exposição à talidomida em peixe-zebra, foi realizada uma série de experiências in vivo com o objetivo de aprimorar a descorionação de embriões, as concentrações eficazes de talidomida e a janela temporal de desenvolvimento embrionário do peixe-zebra para exposição à talidomida. Posteriormente, o impacto da talidomida nos embriões de peixe-zebra foi avaliado analisando deformações das barbatanas peitorais em larvas aos 4 dias pós-fertilização, após coloração com azul de Alcian, e por análise de expressão génica por qPCR. Para complementar os resultados obtidos, visando entender o impacto da talidomida no metabolismo da mineralização dos tecidos, foram realizados vários ensaios in vitro em VSa13, uma linha celular de osteo-condroprogenitores derivada da vértebra de Sparus aurata, num contexto de diferenciação celular e mineralização. Sistemas celulares são um modelo in vitro representativo, de fácil manipulação, que permite a observação direta de fenómenos celulares e interações moleculares sob condições controladas, em oposição à variabilidade em organismos completos. A sua aptidão para investigação de toxicidade e farmacologia (ajudando na identificação de efeitos terapêuticos e adversos) são características que facilitam estudos genéticos tornando-as excelentes modelos de doenças que complementam os estudos in vivo. Com a otimização das condições experimentais, foi possível identificar fenótipo de deformações nas barbatanas peitorais de larvas de peixe-zebra aos 4 dias pós-fertilização após tratamento com uma concentração de 0,05 mg/mL de pronase durante 5 minutos, e subsequente exposição à talidomida a partir das 2 horas após a fertilização (hpf). A concentração mais eficaz de talidomida foi 600 μM, demostrando ter o maior impacto no encurtamento do comprimento das barbatanas peitorais, ainda que com mortalidade associada. A expressão genética confirmou o impacto da talidomida na embriogénese através da regulação negativa dos fatores de transcrição sall4 e sox9a. Além disso, a regulação negativa de col1a1 e a regulação positiva de spp1 sugerem um impacto no metabolismo ósseo. Tal impacto foi confirmado nos ensaios in vitro, em que diferentes concentrações de talidomida (0,1 e 10 μM) promoveram a inibição da mineralização, possivelmente bloqueando a diferenciação terminal, atendendo à regulação negativa do fator de transcrição sp7. O impacto da talidomida na angiogénese também foi investigado e os resultados revelaram a regulação positiva do gene vegfaa e da proteína FLI1, que também foram relatados como contribuindo para malformações dos membros. Com estes resultados, foi possível concluir que a ação molecular da talidomida é complexa e as malformações dos membros devem resultar de uma combinação entre a desregulação da angiogénese e a disfunção de fatores de transcrição reguladores-chave da condrogénese e do metabolismo ósseo.
Em 1957, o sedativo antiemético talidomida foi disseminado como não tóxico e prescrito maioritariamente durante as primeiras 3 semanas de gravidez no alívio dos enjoos matinais durante 4 anos, até que inúmeros abortos e mais de 10.000 crianças foram declaradas afetadas pelo seu efeito teratogénico. Foram observadas várias anomalias congénitas graves em bebés nascidos após as mães terem sido tratadas com talidomida, apresentando deformações em quase todos os tecidos e órgãos possivelmente afetados e uma ampla variabilidade na gravidade de malformações nos membros, olhos, ouvidos, coração, rins, trato gastrointestinal, medula espinal, face/ palato e genitais. No entanto, estudos farmacológicos e moleculares contínuos num esforço para descobrir os efeitos teratogénicos da talidomida levaram à descoberta da sua eficiência contra doenças autoimunes, inibição da produção do factor de transcrição de necrose tumoral (TNF)-alfa e atividade anti-angiogénica (anticancerígena). Estas capacidades levaram à sua aprovação pela FDA e impulsionaram este medicamento tal como os seus derivados a serem prescritos como potentes medicamentos imunomoduladores (IMiDs) no tratamento de uma gama de condições médicas sob devido acompanhamento e supervisão. Os mecanismos moleculares da talidomida permaneceram elusivos durante muitos anos, até que, recentemente, a cereblon (CRBN) foi identificada como o principal alvo da talidomida. Esta proteína funciona como uma subunidade de um complexo de ubiquitina E3 ligase com a DDB1 (Proteína de Ligação ao DNA 1) cuja atividade depende dos substratos que a ele se ligam e, quando complexada com a talidomida, pode promover a degradação de fatores de transcrição-chave envolvidos na embriogénese originando, consequentemente, malformações embrionárias. Algumas das hipóteses propostas para explicar a embriogénese da talidomida envolvem vários mecanismos nomeadamente: Inibição da angiogénese (a talidomida interfere na formação de novos vasos sanguíneos e a sua ramificação), alteração na sinalização celular (afetando vias de sinalização importantes para o desenvolvimento, tal como a via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)), apoptose celular (afetando a morfologia e formação de estruturas embrionárias), desregulação da expressão de fatores de transcrição essenciais à formação dos membros anteriores e outras estruturas anatómicas originando deformações e efeitos imunomoduladores que impactam o desenvolvimento embrionário. O desastre da talidomida levantou questões cruciais sobre a segurança dos medicamentos e a necessidade de avaliações mais abrangentes durante o desenvolvimento farmacêutico. A falta de previsibilidade nos efeitos adversos em humanos, em contraste com os resultados em roedores, evidenciou a importância de se considerar a variabilidade entre espécies ao testar novas drogas, destacando a importância de um rigoroso processo de triagem para a prescrição deste medicamento. Estudos demonstraram que roedores não são suscetíveis aos efeitos teratogénicos e terapêuticos da talidomida e dos seus derivados, devido a diferenças em determinados aminoácidos que inibem a ligação da talidomida ao seu alvo primário: o CEREBLON. Em resposta à variada suscetibilidade de diferentes espécies aos danos causados pela talidomida, que se identificaram através de análises comparativas fenotípicas e genómicas, no presente, novos medicamentos candidatos são testados em pelo menos duas espécies animais (sendo uma delas não roedor) antes de serem submetidos a testes clínicos. O peixe-zebra (Danio rerio) é um modelo animal cujo uso em estudos fármaco-toxicológicos tem aumentado para o estudo de distúrbios esqueléticos humanos, uma vez que os processos de ossificação e homeostase apresentam várias semelhanças anatómicas e genéticas, e porque o seu ciclo de vida curto, elevado número de descendentes e a sua transparência (permitindo a observação direta do desenvolvimento e avaliação de processos biológicos em tempo real) são vantajosos para estudos embrionários e de desenvolvimento. Além disso, demonstrou ser suscetível aos efeitos anti-angiogénicos da talidomida e, possivelmente, a outros danos teratogénicos. Com este estudo, pretendemos usar o peixe-zebra como modelo biológico para entender os eventos moleculares associados às embriopatias causadas pela talidomida e identificar de que forma o metabolismo ósseo pode ser afetado. Para otimizar a metodologia de exposição à talidomida em peixe-zebra, foi realizada uma série de experiências in vivo com o objetivo de aprimorar a descorionação de embriões, as concentrações eficazes de talidomida e a janela temporal de desenvolvimento embrionário do peixe-zebra para exposição à talidomida. Posteriormente, o impacto da talidomida nos embriões de peixe-zebra foi avaliado analisando deformações das barbatanas peitorais em larvas aos 4 dias pós-fertilização, após coloração com azul de Alcian, e por análise de expressão génica por qPCR. Para complementar os resultados obtidos, visando entender o impacto da talidomida no metabolismo da mineralização dos tecidos, foram realizados vários ensaios in vitro em VSa13, uma linha celular de osteo-condroprogenitores derivada da vértebra de Sparus aurata, num contexto de diferenciação celular e mineralização. Sistemas celulares são um modelo in vitro representativo, de fácil manipulação, que permite a observação direta de fenómenos celulares e interações moleculares sob condições controladas, em oposição à variabilidade em organismos completos. A sua aptidão para investigação de toxicidade e farmacologia (ajudando na identificação de efeitos terapêuticos e adversos) são características que facilitam estudos genéticos tornando-as excelentes modelos de doenças que complementam os estudos in vivo. Com a otimização das condições experimentais, foi possível identificar fenótipo de deformações nas barbatanas peitorais de larvas de peixe-zebra aos 4 dias pós-fertilização após tratamento com uma concentração de 0,05 mg/mL de pronase durante 5 minutos, e subsequente exposição à talidomida a partir das 2 horas após a fertilização (hpf). A concentração mais eficaz de talidomida foi 600 μM, demostrando ter o maior impacto no encurtamento do comprimento das barbatanas peitorais, ainda que com mortalidade associada. A expressão genética confirmou o impacto da talidomida na embriogénese através da regulação negativa dos fatores de transcrição sall4 e sox9a. Além disso, a regulação negativa de col1a1 e a regulação positiva de spp1 sugerem um impacto no metabolismo ósseo. Tal impacto foi confirmado nos ensaios in vitro, em que diferentes concentrações de talidomida (0,1 e 10 μM) promoveram a inibição da mineralização, possivelmente bloqueando a diferenciação terminal, atendendo à regulação negativa do fator de transcrição sp7. O impacto da talidomida na angiogénese também foi investigado e os resultados revelaram a regulação positiva do gene vegfaa e da proteína FLI1, que também foram relatados como contribuindo para malformações dos membros. Com estes resultados, foi possível concluir que a ação molecular da talidomida é complexa e as malformações dos membros devem resultar de uma combinação entre a desregulação da angiogénese e a disfunção de fatores de transcrição reguladores-chave da condrogénese e do metabolismo ósseo.
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Keywords
Talidomida Embriopatia Desenvolvimento dos membros