Development of a commercial microalgae enrichment for optimizing zebrafish reproduction

Castro, Daniela Tomás de

http://hdl.handle.net/10400.1/17533

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Authors

Castro, Daniela Tomás de

Advisor(s)

Gavaia, Paulo Jorge Travessa

Pereira, Hugo Galvão Caiano

Abstract(s)

O peixe zebra (Danio rerio) é um teleósteo tropical de água doce, amplamente utilizado como espécie modelo em diferentes áreas científicas, nomeadamente genética, biologia do desenvolvimento, nutrição, cosmética e no estudo de doenças humanas, entre outras. Esta larga utilização resulta de diferentes vantagens do peixe zebra, tais como a dimensão pequena, o rápido desenvolvimento, o curto ciclo de vida, a transparência durante o desenvolvimento e a facilidade de manutenção e a fecundidade e predictabilidade da reprodução. Apesar de ser uma espécie tão utilizada, os seus requerimentos nutricionais são ainda pouco conhecidos, pelo que os biotérios de diferentes universidades e /ou laboratórios utilizam rações ou estratégias de alimentação não estandardizadas, o que dificulta ou inviabiliza a replicação e comparação de resultados entre diferentes estudos. Algumas destas estratégias combinam a utilização de presas vivas, tais como a artémias ou rotíferos, com ração. A utilização das presas vivas ocorre maioritariamente nos estágios iniciais do desenvolvimento devido ao tamanho pequeno e reduzida velocidade de natação, o que permite estimular o comportamento predatório e assim reduzir o stress de catividade, funcionando também como enriquecimento ambiental. Para além disso, os rotíferos são conhecidos como filtradores não seletivos, o que permite um enriquecimento específico, utilizando por exemplo microalgas ou meios de enriquecimento comerciais. As microalgas têm um perfil nutricional rico em proteínas, lípidos e antioxidantes, mas também em micronutrientes como vitaminas e minerais. A presença de antioxidantes nas microalgas permite aumentar a qualidade dos gâmetas e a performance reprodutiva, contribuindo para uma redução dos danos no processo da gametogénese, tornando assim a utilização de presas vivas como enriquecimento útil na alimentação de adultos. Este trabalho pretende avaliar o efeito de diferentes microalgas, de forma isolada ou combinadas entre si, na performance reprodutiva e, consequentemente na qualidade da descendência do peixe-zebra. Desta forma, o estudo foi dividido em dois ensaios, aonde no primeiro foi avaliado o efeito do enriquecimento de rotíferos com microalgas fornecidos como alimento aos machos reprodutores. Para tal, foram desenhados seis tratamentos, sendo o primeiro composto pela microdieta Zebrafeed®, utilizada como controlo e também como alimento base em todos os outros tratamentos, que foram complementados com rotíferos enriquecidos com diferentes espécies de microalgas, Nannochloropsis sp., Tisochrysis lutea, Dunaliella salina e Haematococcus pluvialis. Para avaliar o efeito desta alimentação foram avaliados, fecundidade, fertilidade, o número de ovos por tratamento, a dimensão dos ovos e do seu vitelo, a sobrevivência às 24 horas pós fertilização e aos 5 dias pós fertilização. A utilização de dimensões dos ovos é importante porque a contribuição parental influencia a epigenética, que por sua vez influencia o tamanho do embrião. O tamanho do embrião pode ser obtido através da subtração do tamanho do vitelo ao tamanho do ovo. Foram também avaliadas as dimensões das larvas relativamente a comprimento e profundidade e, por último ao 6º dia foram realizadas medições à área da cabeça e à área mineralizada do opérculo após o mesmo ser corado com vermelho de alizarina, para obter o rácio de área mineralizada nos diferentes tratamentos. Os resultados demonstraram que ovos descendentes de machos alimentados com Zebrafeed® e rotíferos enriquecidos com as diferentes misturas não tiveram diferenças significativas no número de ovos, na área e vitelo dos ovos. Machos alimentados com rotíferos enriquecidos com a combinação de todas as microalgas utilizadas neste ensaio contribuíram para uma descendência de larvas com menor comprimento. Foi então concluído que a utilização de rotíferos enriquecidos com Nannochloropsis sp. e D. salina na dieta dos machos contribui para um bom número de ovos e um maior comprimento de larvas, sendo, portanto, útil a sua utilização num biotério, uma vez que o seu objetivo é produzir um vasto número de ovos e larvas de qualidade. No segundo ensaio o objetivo foi avaliar o efeito na performance reprodutiva induzido através da utilização de diferentes microalgas como enriquecimento de rotíferos na alimentação das fêmeas. Foram desenhados oito tratamentos diferentes, todos eles incluindo Zebrafeed®, a microdieta utilizada como controlo. Para isso, foram avaliados os mesmos parâmetros que no primeiro ensaio e ainda, foram realizadas análises por real time PCR a ARN de ovos das fêmeas alimentadas com os diferentes tratamentos para quantificar a expressão de genes marcadores de qualidade. Os resultados demonstraram que fêmeas alimentadas com rotíferos enriquecidos com Nannochloropsis sp. e D. salina, ou com rotíferos enriquecidos em Nannochloropsis sp., ou Nannochloropsis sp. e T. lutea originaram um maior número de ovos e fêmeas alimentadas com rotíferos enriquecidos com Nannochloropsis sp., S. costatum e D. salina originaram ovos com menor diâmetro e com menor vitelo. Através da análise da expressão relativa de genes herdados maternalmente e usados como biomarcadores de qualidade (npm2a, otulina, slc29a1a, rpf2 e rtn4ip1) foi possível verificar que existe um efeito da dieta da progenitora na expressão relativa dos mesmos e, comparando a expressão dos mesmos genes na primeira e na sexta reprodução que existe um efeito diferenciado ao longo do tempo. Para ambos os ensaios foram ainda realizadas análises bioquímicas para avaliar o conteúdo de proteínas totais, lípidos totais, carbohidratos totais, cinzas totais, perfil de ácidos gordos (FAME) e conteúdo mineral das diferentes microalgas e dos rotíferos enriquecidos com as diferentes misturas. Observou-se que o mineral mais abundante das microalgas é o potássio (K) e o mineral mais abundante dos rotíferos enriquecidos, em ambos os ensaios, é o sódio (Na). Os resultados demonstraram que existiam diferenças entre a composição bioquímica das misturas das algas e a composição dos rotíferos enriquecidos, devido à capacidade de sintetizar ARA e EPA dos rotíferos. A utilização de rotíferos enriquecidos com Nannochloropsis sp. e D. salina na dieta das fêmeas contribuiu para um maior número de ovos, com maior área, e sem impacto na qualidade larvar, o que é benéfico para a gestão de um biotério e para a otimização da performance reprodutiva. Este trabalho indica que a utilização de rotíferos enriquecidos com microalgas juntamente com a microdieta promove um aumento da performance reprodutiva e da qualidade larvar, independentemente do facto deste suplemento alimentar ser dado aos machos ou às fêmeas, ainda que tenha mais impacto nas fêmeas. Futuramente seria importante investigar estas e outras espécies de microalgas em diferentes quantidades, bem como investigar o efeito da melhor mistura em ambos os sexos isoladamente e conjuntamente. Este estudo contribuiu para uma maior perceção do efeito da nutrição parental e maternal na qualidade da descendência e também para uma otimização dos protocolos alimentares utilizando rotíferos enriquecidos com microalgas.

Zebrafish is an important model species; however, its nutritional requirements are poorly understood. Numerous dietary regimes are used among research facilities, includ-ing live preys enriched with microalgae. Different diets promote high variability on re-productive performance and egg output between facilities, which constitutes a bottleneck. Microalgae are valuable sources of nutrients and bioactive compounds. This work inves-tigates different microalgae species and blends in breeders’ dietary supplements as a tool to boost reproductive performance. For this purpose, two trials were made, one where only the males had a dietary supplementation based on rotifers enriched with microalgae, and a second one where only the females had a supplementation. In both trials were used two control diets, one composed by Zebrafeed® and the other by Zebrafeed® and rotifers enriched with Nannochloropsis sp. Reproductive performance was evaluated according to the number of eggs, hatching rate, standard offspring length at 5 days postfertilization (dpf), and the degree of mineralization of the operculum at 6 dpf. The experimental results showed that males fed with rotifers enriched with different microalgae species do not have differences in the number of laid eggs, and area and yolk area. It was also observed that females fed with rotifers enriched with a blend of Nannochloropsis sp. and D. salina originated more eggs, with higher areas without affecting larvae length, whereas females fed with rotifers enriched with a blend of Nannochloropsis sp. and T. lutea displayed eggs with a larger diameter and larger yolk. The use of a higher amount of proteins on the diet will increase larvae length. Relative gene expression was influenced by maternal feeding regimes and was also observed, that zebrafish needs a period of time to get familiar with a different diet. This work allowed to conclude that using a combination of microdiet and rotifers encapsulated with microalgae, namely with Nannochloropsis sp. and D.salina improves reproductive performance and offspring quality.