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Regulation of pre-mRNA splicing during Drosophila development
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 101.74 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
The spliceosome is a very dynamic molecular machine, whose compositional
and conformational remodeling is crucial for pre-mRNA splicing. Although
splicing is biochemically simple, with essentially two nucleophilic attacks, the
spliceosome is nevertheless remarkably complex, as it needs to be in one
hand extremely precise in splice-site recognition, but in the other hand must
accommodate an array of alternative splicing events capable of generating
transcript diversity. Multiple studies in yeast and human cells have shown that
loss of distinct subunits of the spliceosome impaired splicing of distinct
subsets of introns (Dix et al, 1999; Lygerou et al, 1999; Larson et al, 2016),
suggesting a significant degree of splicing plasticity among different classes of
introns.
To better understand the contribution of such splicing plasticity to differential
gene expression during development of multicellular organisms, we
performed a screen to identify spliceosome subunits whose depletion by RNA
interference (RNAi) was associated to specific phenotypes during oogenesis
and/or early embryonic development. Our working hypothesis is that those
subunits would be particularly rate limiting for splicing of small subsets of
introns. We identified Salsa, a subunit of the spliceosome Nine Teen Complex
(NTC), as being required for dorsal ventral (D/V) patterning of the Drosophila
egg.
Germ-line specific depletion of Salsa during oogenesis produced a highly
penetrant ventralization phenotype (spindle phenotype) and dramatically
reduced fertility. Since Gurken expression (a TGFα family signaling ligand) is
crucial for D/V patterning of the developing oocyte, we decided to investigate
if Salsa was rate limiting for Gurken expression. We observed that splicing of
the first intron of gurken transcript was particularly sensitive to Salsa
depletion, whereas anterior dorsal localization of gurken mRNA, and
consequently Gurken protein, was highly abnormal. Since it was previously
suggested that the 5´UTR of gurken is important for its anterior dorsal
localization (Saunders & Cohen, 1999a), our current working model is that
retention of the proximal intron, within the 5´UTR of gurken transcript, disturbs
the folding of an unknown RNA motif important for its correct localization. Interestingly, analysis of the Drosophila ovaries transcriptome after depletion
of Salsa further confirmed that this RNA helicase is particularly rate limiting for
splicing of small proximal introns; including for example the proximal 5´UTRlocalized
intron of tra2, a gene whose alternative splicing is crucial for sexdetermination.
O spliceosoma é uma máquina molecular extremamente dinâmica com variações constates na sua composição e conformação, sendo estas modificações cruciais para o splicing do pré-RNA mensageiro (pré-mRNA). A complexidade do spliceosoma contrasta com a simplicidade bioquímica da reação de splicing, que consiste essencialmente em dois ataques nucleofílicos. Esta complexidade deve-se ao facto de o spliceosoma ter de ser extremamente preciso no reconhecimento dos splice-sites e simultaneamente ter a plasticidade necessária para a realização de inúmeros eventos de splicing diferentes essenciais para a formação de diversidade transcricional. Vários estudos em levedura e células humanas demostraram que remoção de diferentes subunidades do spliceosoma afeta o splicing de diferentes subgrupos de intrões (Dix et al, 1999; Lygerou et al, 1999; Larson et al, 2016), sugerindo um elevado grau de plasticidade no splicing de diferentes tipos de intrões. Para compreender melhor a contribuição desta plasticidade para a expressão génica durante o desenvolvimento de organismos multicelulares, realizámos um screen genético para identificar subunidades do spliceosoma cuja depleção por RNA de interferência (RNAi) está associada a fenótipos específicos durante a oogénese e/ou desenvolvimento embrionário. A nossa hipótese é que essas subunidades serão particularmente limitantes para o splicing de pequenos subgrupos de intrões. Com este screen nós identificamos Salsa, uma subunidade do complexo Nine Teen (NTC) do spliceosome, como sendo necessária para a formação de um gradiente dorso/ventral (D/V) no ovo de Drosophila. A depleção de Salsa na linha germinal durante a oogénese originou um fenótipo de ventralização altamente penetrante (fenótipo de spindle) e reduziu drasticamente a fertilidade. Como a expressão de Gurken (um ligante da família TGFα) é crucial para a formação do gradiente D/V no oócito durante o desenvolvimento, decidimos investigar se Salsa era limitante para expressão de Gurken. Observamos que o splicing do primeiro intrão do transcrito de gurken foi particularmente sensível à depleção de Salsa. Paralelamente verificamos que a localização dorso-anterior do mRNA de gurken e, consequentemente, da proteína de Gurken, era altamente anormal após depleção de Salsa. Uma vez que foi previamente observado que o 5'UTR do mRNA de gurken é importante para sua localização dorso-anterior (Saunders & Cohen, 1999b), propomos que a retenção do primeiro intrão (dentro do 5'UTR do mRNA de gurken) interfere na sua conformação e consequentemente na formação de um motivo de reconhecimento de RNA importante para a sua correta localização. Curiosamente, a análise do transcritoma de ovários de Drosophila após depleção de Salsa confirmou que esta helicase de RNA é particularmente limitante para o splicing de pequenos intrões próximos do início do transcrito; incluindo, por exemplo, o intrão localizado no 5'UTR do mRNA de tra2, um gene cujo splicing alternativo é crucial para a determinação do sexo.
O spliceosoma é uma máquina molecular extremamente dinâmica com variações constates na sua composição e conformação, sendo estas modificações cruciais para o splicing do pré-RNA mensageiro (pré-mRNA). A complexidade do spliceosoma contrasta com a simplicidade bioquímica da reação de splicing, que consiste essencialmente em dois ataques nucleofílicos. Esta complexidade deve-se ao facto de o spliceosoma ter de ser extremamente preciso no reconhecimento dos splice-sites e simultaneamente ter a plasticidade necessária para a realização de inúmeros eventos de splicing diferentes essenciais para a formação de diversidade transcricional. Vários estudos em levedura e células humanas demostraram que remoção de diferentes subunidades do spliceosoma afeta o splicing de diferentes subgrupos de intrões (Dix et al, 1999; Lygerou et al, 1999; Larson et al, 2016), sugerindo um elevado grau de plasticidade no splicing de diferentes tipos de intrões. Para compreender melhor a contribuição desta plasticidade para a expressão génica durante o desenvolvimento de organismos multicelulares, realizámos um screen genético para identificar subunidades do spliceosoma cuja depleção por RNA de interferência (RNAi) está associada a fenótipos específicos durante a oogénese e/ou desenvolvimento embrionário. A nossa hipótese é que essas subunidades serão particularmente limitantes para o splicing de pequenos subgrupos de intrões. Com este screen nós identificamos Salsa, uma subunidade do complexo Nine Teen (NTC) do spliceosome, como sendo necessária para a formação de um gradiente dorso/ventral (D/V) no ovo de Drosophila. A depleção de Salsa na linha germinal durante a oogénese originou um fenótipo de ventralização altamente penetrante (fenótipo de spindle) e reduziu drasticamente a fertilidade. Como a expressão de Gurken (um ligante da família TGFα) é crucial para a formação do gradiente D/V no oócito durante o desenvolvimento, decidimos investigar se Salsa era limitante para expressão de Gurken. Observamos que o splicing do primeiro intrão do transcrito de gurken foi particularmente sensível à depleção de Salsa. Paralelamente verificamos que a localização dorso-anterior do mRNA de gurken e, consequentemente, da proteína de Gurken, era altamente anormal após depleção de Salsa. Uma vez que foi previamente observado que o 5'UTR do mRNA de gurken é importante para sua localização dorso-anterior (Saunders & Cohen, 1999b), propomos que a retenção do primeiro intrão (dentro do 5'UTR do mRNA de gurken) interfere na sua conformação e consequentemente na formação de um motivo de reconhecimento de RNA importante para a sua correta localização. Curiosamente, a análise do transcritoma de ovários de Drosophila após depleção de Salsa confirmou que esta helicase de RNA é particularmente limitante para o splicing de pequenos intrões próximos do início do transcrito; incluindo, por exemplo, o intrão localizado no 5'UTR do mRNA de tra2, um gene cujo splicing alternativo é crucial para a determinação do sexo.
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Keywords
Regulation Pre-mRNA splicing Drosophila