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The impact of bacteria-microalgae co-cultivation on the growth and productivity of Tisochrysis lutea
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Abstract(s)
Nowadays, the lack of essential resources, such as food and water, has been the cause of worldwide concern. Therefore, new alternatives are being increasingly researched to tackle these global demands. Microalgae are a possible alternative to obtain compounds (e.g., proteins and fatty acids) that can be applied to several economic sectors, such as the food, feed or pharmaceutical industries. In nature, these eukaryotes share their habitat with various microorganisms. With them, microalgae can establish a wide variety of interactions, ranging from parasitism to mutualistic relations, which often involve the exchange of compounds, such as organic matter and vitamins, required for the development and survival of the involved organisms. However, despite microalgae potential for industrial purposes, the impact of their naturally occurring bacteriome in the cultures is still overlooked or viewed negatively since bacteria are often considered as undesired contaminants. In this thesis, 145 bacteria were identified in the industrial cultures of the microalga Tisochrysis lutea, a species produced primarily for the aquaculture industry, due to the high content of polyunsaturated fatty acids (PUFA) and pigments. Of those, 7 strains showed potential to improve the productivity or biochemical composition of T. lutea upon co-culture with this microalga. Simple “tailor-made” bacterial mixes were then designed to optimize the production of this haptophyte. Among the 21 combinations assayed, 6 were associated with a significant productivity increase, ranging from 30 to 58%. In addition, 5 combinations were correlated with elevated concentrations of methylcobalamin and 3 with enhanced concentrations of some PUFA (16:2n-6, 18:3n-3α, and 22:5n-3). Through this work, we enhanced the biomass production and productivity of bioactive compounds in T. lutea at the laboratory scale by adding custom bacterial blends to the already xenic cultures of this microalga. This represents a significant step to improve the industrial production of this haptophyte with important biotechnological applications.
Atualmente, recursos essenciais, como água, alimento e recursos energéticos, estão a ser consumidos a ritmos alarmantes, sendo, por isso, causa de preocupação em todo o mundo. Como consequência, está a aumentar a pesquisa de alternativas sustentáveis. Nesse âmbito, as microalgas estão a ser estudadas como uma opção alternativa para suprir algumas destas necessidades, visto que na sua biomassa conseguem acumular uma grande diversidade de compostos, como pigmentos, proteínas, ácidos gordos e vitaminas, que podem ser utilizados em várias indústrias, tais como, a farmacêutica, cosmética, bioenergia, suplementação alimentar e ração animal. No entanto, a produção à escala industrial destes microrganismos ainda acarreta elevados custos, sendo necessário otimizar a produção industrial de microalgas, de forma a recolher maiores quantidades de biomassa, contendo os compostos desejados, com o menor custo possível. Na natureza, estes eucariontes unicelulares estão presentes em praticamente todo o tipo de habitats aquáticos (marinhos e água doce) e também em alguns terrestres, onde coexistem com outros microrganismos, como, por exemplo, fungos ou bactérias. Microalgas e bactérias podem estabelecer entre si interações, que podem ser antagonistas, no caso de competição ou parasitismo, ou benéficas, como, por exemplo, o mutualismo. Relações mutualísticas estabelecem-se essencialmente através de trocas de compostos, como matéria orgânica, fatores de crescimento, vitaminas e compostos inorgânicos (CO2), na maioria das vezes essenciais para o normal desenvolvimento e sobrevivência de ambos os organismos. Por exemplo, as bactérias são capazes de produzir vitaminas, como a vitamina B12 (ou cobalamina), que são essenciais para várias espécies de microalgas, e em troca recebem matéria orgânica, produzida pelas algas. No entanto, apesar de estas interações serem reportadas em ambientes naturais, o efeito de bactérias em culturas de produção industrial de microalgas ainda é pouco estudado, especialmente considerando que as bactérias, na sua maioria, são classificadas como organismos invasores que contaminam culturas. Apesar disto, alguns estudos recentes apontam a co-cultura de microalgas com outros microrganismos (fungos ou bactérias) como uma alternativa para otimizar a produção industrial de microalgas, de modo a obter não só maiores quantidades de biomassa, mas também biomassa de melhor qualidade, enriquecida em compostos de interesse. A microalga Tisochrysis lutea é uma espécie de interesse industrial atualmente, essencialmente devido ao seu perfil nutricional. A sua biomassa contém elevadas quantidades de ácidos gordos polinsaturados, como o ácido docosahexenoico, que é essencial na dieta de peixes, crustáceos, e outros organismos aquáticos, especialmente nas fases iniciais do crescimento, sendo por isso importante para a indústria de aquacultura. Esta microalga também têm um alto conteúdo de pigmentos (essencialmente fucoxantina) com atividade antioxidante e anti-inflamatória. No decorrer desta tese, cerca de 145 bactérias foram isoladas e identificadas a partir de amostras recolhidas em reatores industriais utilizados na produção de T. lutea. A maioria das bactérias identificadas estavam incluídas nas classes Gammaproteobacteria e Actinomycetes, enquanto Bacilli, Cytophagia e Saprospiria foram as classes menos representadas. De acordo com informação bibliográfica recolhida para as espécies identificadas, 40 foram selecionadas para ensaios de co-cultura, sendo que inicialmente apenas um isolado bacteriano era inserido na cultura de T. lutea. No decorrer do primeiro ensaio, no dia 5, as culturas inoculadas com 8 dos isolados colapsaram, enquanto, no final do ensaio, 16 outras bactérias estiveram associadas a efeitos negativos no crescimento da microalga, visto que a concentração celular nestas culturas era significativamente menor do que nas culturas de controlo. Contrariamente a isto, as co-culturas com o isolado 80 (Roseovarius sp.) registaram um aumento significativo nas contagens celulares da microalga. As 13 bactérias associadas a culturas com os melhores resultados de produtividade de T. lutea e 2 bactérias reportadas na literatura como produtoras de vitamina B12 foram selecionadas para um novo ensaio em co-cultura com a microalga. Neste ensaio, a bactéria que, quando inoculada com T. lutea, levou ao maior crescimento da microalga foi o isolado 84, identificado como Haliea salexigens. O crescimento bacteriano também foi quantificado, por CFU, no início e fim da experiência. Enquanto em 5 das bactérias testadas (Halomonas alkaliphila, Cyclobacterium sp., Roseovarius sp., Priestia flexa e Haliea salexigens), a concentração bacteriana por mL de cultura aumentou, em outras 4 estirpes (Arenibacter sp., Microbacterium sp., Brevibacterium sp. e Pseudidiomarina maritima), aconteceu o oposto, registando-se uma diminuição da carga bacteriana nas culturas, ao longo do ensaio. No fim desta experiência, a biomassa recolhida foi coletada para análises bioquímicas. Apenas a cultura contendo o isolado 78 (Microbacterium sp.) obteve um aumento significativo no conteúdo de proteínas. Porém, nos perfis de ácidos gordos e de pigmentos, nenhuma das culturas inoculadas com os isolados selecionados demonstraram aumentos significativos. Em relação às medições de concentração de metilcobalamina, uma forma comum de vitamina B12 em organismos vivos, as culturas contendo isolados reportados na literatura como produtores de vitamina B12, nomeadamente Halomonas alkaliphila, Roseovarius sp. and Alcaligenes faecalis, atingiram as maiores concentrações deste nutriente. Considerando o conjunto de resultados obtidos ao longo da fase I do projeto, 7 dos isolados testados foram selecionados para a fase seguinte, onde foram combinados em pares e novamente co-inoculados com a microalga. Das 21 combinações de bactérias testadas, 6 (7/132, 8/78, 8/116, 78/84, 80/132 and 84/132) corresponderam a um crescimento mais elevado de T. lutea, em cerca de 30 a 58%, quando comparado com o controlo. Em culturas contendo algumas destas misturas bacterianas (78/84, 80/132 and 84/132), esta melhoria no crescimento, também correspondeu a elevadas concentrações de metilcobalamina. Também foram detetados aumentos nas concentrações de alguns ácidos gordos polinsaturados, nomeadamente hexadecadienóico (16:2n-6), α-linolénico (ALA, 18:3n-3α) e/ou docosapentenóico (DPA, 20:5n-3), nas culturas onde foram adicionadas as combinações de Microbacterium sp. com Alcaligenes faecalis, Marinobacter sp. e Haliea salexigens, e também nos replicados inoculados com a combinação de Marinobacter sp. com Alcaligenes faecalis. Contudo, no conteúdo proteico da microalga e no perfil de pigmentos não se registaram melhorias em comparação com o controlo. Para concluir, ainda são necessários mais testes para melhor entender as dinâmicas da comunidade após a adição das combinações bacterianas, e como podemos aproveitar as interações entre estes microrganismos para melhorar produtividade e produção de compostos biológicos de interesse industrial. Para além disto, uma validação destes resultados em culturas de escala industrial é necessária, visto que todos os resultados foram obtidos em culturas de escala laboratorial.
Atualmente, recursos essenciais, como água, alimento e recursos energéticos, estão a ser consumidos a ritmos alarmantes, sendo, por isso, causa de preocupação em todo o mundo. Como consequência, está a aumentar a pesquisa de alternativas sustentáveis. Nesse âmbito, as microalgas estão a ser estudadas como uma opção alternativa para suprir algumas destas necessidades, visto que na sua biomassa conseguem acumular uma grande diversidade de compostos, como pigmentos, proteínas, ácidos gordos e vitaminas, que podem ser utilizados em várias indústrias, tais como, a farmacêutica, cosmética, bioenergia, suplementação alimentar e ração animal. No entanto, a produção à escala industrial destes microrganismos ainda acarreta elevados custos, sendo necessário otimizar a produção industrial de microalgas, de forma a recolher maiores quantidades de biomassa, contendo os compostos desejados, com o menor custo possível. Na natureza, estes eucariontes unicelulares estão presentes em praticamente todo o tipo de habitats aquáticos (marinhos e água doce) e também em alguns terrestres, onde coexistem com outros microrganismos, como, por exemplo, fungos ou bactérias. Microalgas e bactérias podem estabelecer entre si interações, que podem ser antagonistas, no caso de competição ou parasitismo, ou benéficas, como, por exemplo, o mutualismo. Relações mutualísticas estabelecem-se essencialmente através de trocas de compostos, como matéria orgânica, fatores de crescimento, vitaminas e compostos inorgânicos (CO2), na maioria das vezes essenciais para o normal desenvolvimento e sobrevivência de ambos os organismos. Por exemplo, as bactérias são capazes de produzir vitaminas, como a vitamina B12 (ou cobalamina), que são essenciais para várias espécies de microalgas, e em troca recebem matéria orgânica, produzida pelas algas. No entanto, apesar de estas interações serem reportadas em ambientes naturais, o efeito de bactérias em culturas de produção industrial de microalgas ainda é pouco estudado, especialmente considerando que as bactérias, na sua maioria, são classificadas como organismos invasores que contaminam culturas. Apesar disto, alguns estudos recentes apontam a co-cultura de microalgas com outros microrganismos (fungos ou bactérias) como uma alternativa para otimizar a produção industrial de microalgas, de modo a obter não só maiores quantidades de biomassa, mas também biomassa de melhor qualidade, enriquecida em compostos de interesse. A microalga Tisochrysis lutea é uma espécie de interesse industrial atualmente, essencialmente devido ao seu perfil nutricional. A sua biomassa contém elevadas quantidades de ácidos gordos polinsaturados, como o ácido docosahexenoico, que é essencial na dieta de peixes, crustáceos, e outros organismos aquáticos, especialmente nas fases iniciais do crescimento, sendo por isso importante para a indústria de aquacultura. Esta microalga também têm um alto conteúdo de pigmentos (essencialmente fucoxantina) com atividade antioxidante e anti-inflamatória. No decorrer desta tese, cerca de 145 bactérias foram isoladas e identificadas a partir de amostras recolhidas em reatores industriais utilizados na produção de T. lutea. A maioria das bactérias identificadas estavam incluídas nas classes Gammaproteobacteria e Actinomycetes, enquanto Bacilli, Cytophagia e Saprospiria foram as classes menos representadas. De acordo com informação bibliográfica recolhida para as espécies identificadas, 40 foram selecionadas para ensaios de co-cultura, sendo que inicialmente apenas um isolado bacteriano era inserido na cultura de T. lutea. No decorrer do primeiro ensaio, no dia 5, as culturas inoculadas com 8 dos isolados colapsaram, enquanto, no final do ensaio, 16 outras bactérias estiveram associadas a efeitos negativos no crescimento da microalga, visto que a concentração celular nestas culturas era significativamente menor do que nas culturas de controlo. Contrariamente a isto, as co-culturas com o isolado 80 (Roseovarius sp.) registaram um aumento significativo nas contagens celulares da microalga. As 13 bactérias associadas a culturas com os melhores resultados de produtividade de T. lutea e 2 bactérias reportadas na literatura como produtoras de vitamina B12 foram selecionadas para um novo ensaio em co-cultura com a microalga. Neste ensaio, a bactéria que, quando inoculada com T. lutea, levou ao maior crescimento da microalga foi o isolado 84, identificado como Haliea salexigens. O crescimento bacteriano também foi quantificado, por CFU, no início e fim da experiência. Enquanto em 5 das bactérias testadas (Halomonas alkaliphila, Cyclobacterium sp., Roseovarius sp., Priestia flexa e Haliea salexigens), a concentração bacteriana por mL de cultura aumentou, em outras 4 estirpes (Arenibacter sp., Microbacterium sp., Brevibacterium sp. e Pseudidiomarina maritima), aconteceu o oposto, registando-se uma diminuição da carga bacteriana nas culturas, ao longo do ensaio. No fim desta experiência, a biomassa recolhida foi coletada para análises bioquímicas. Apenas a cultura contendo o isolado 78 (Microbacterium sp.) obteve um aumento significativo no conteúdo de proteínas. Porém, nos perfis de ácidos gordos e de pigmentos, nenhuma das culturas inoculadas com os isolados selecionados demonstraram aumentos significativos. Em relação às medições de concentração de metilcobalamina, uma forma comum de vitamina B12 em organismos vivos, as culturas contendo isolados reportados na literatura como produtores de vitamina B12, nomeadamente Halomonas alkaliphila, Roseovarius sp. and Alcaligenes faecalis, atingiram as maiores concentrações deste nutriente. Considerando o conjunto de resultados obtidos ao longo da fase I do projeto, 7 dos isolados testados foram selecionados para a fase seguinte, onde foram combinados em pares e novamente co-inoculados com a microalga. Das 21 combinações de bactérias testadas, 6 (7/132, 8/78, 8/116, 78/84, 80/132 and 84/132) corresponderam a um crescimento mais elevado de T. lutea, em cerca de 30 a 58%, quando comparado com o controlo. Em culturas contendo algumas destas misturas bacterianas (78/84, 80/132 and 84/132), esta melhoria no crescimento, também correspondeu a elevadas concentrações de metilcobalamina. Também foram detetados aumentos nas concentrações de alguns ácidos gordos polinsaturados, nomeadamente hexadecadienóico (16:2n-6), α-linolénico (ALA, 18:3n-3α) e/ou docosapentenóico (DPA, 20:5n-3), nas culturas onde foram adicionadas as combinações de Microbacterium sp. com Alcaligenes faecalis, Marinobacter sp. e Haliea salexigens, e também nos replicados inoculados com a combinação de Marinobacter sp. com Alcaligenes faecalis. Contudo, no conteúdo proteico da microalga e no perfil de pigmentos não se registaram melhorias em comparação com o controlo. Para concluir, ainda são necessários mais testes para melhor entender as dinâmicas da comunidade após a adição das combinações bacterianas, e como podemos aproveitar as interações entre estes microrganismos para melhorar produtividade e produção de compostos biológicos de interesse industrial. Para além disto, uma validação destes resultados em culturas de escala industrial é necessária, visto que todos os resultados foram obtidos em culturas de escala laboratorial.
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Keywords
Microalgas Bactéria Mutualismo Co-cultura Tisochrysis lutea Promotor de crescimento