Determining the functional interactions of inducers/inhibitor compounds in controlling the ramA locus in Klebsiella pneumoniae

Brito, Lauro David Silva de

http://hdl.handle.net/10400.1/11028

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Authors

Brito, Lauro David Silva de

Advisor(s)

Schneiders, Thamarai

Santos, Nuno R. dos

Abstract(s)

Nas últimas décadas, as bactérias multiresistentes tornaram-se numa das principais ameaças à saúde global, desenvolvendo mecanismos e estratégias para ultrapassar os mais recentes avanços da ciência. A família das Enterobacteriaceae conta com vários exemplos de espécies multiresistentes, entre as quais a espécie Klebsiella pneumoniae, um patogénio nosocomial oportunístico, causador de infecções associadas aos cuidados de saúde, com grande capacidade de adaptação a diferentes ambientes e resistência a um grande leque de terapias. Estes agentes patogénicos adquirem resistência das mais variadas formas, quer acidentalmente através de mutações espontâneas como também podem alterar os níveis de produção e as funcionalidades de certos genes. Estas alterações podem influenciar exclusivamente o alvo de determinadas drogas como podem afectar todo um locus e consequentemente um leque de genes e/ou proteínas dependentes deste. A aquisição de resistência através da alteração de genes e/ou proteínas reguladoras é de especial interesse, pois raramente estes factores de transcrição servem unicamente para controlar os níveis de resistência, intervindo e controlando também o metabolismo e fisiologia bacteriana, podendo assim ser apresentados como alvos alternativos para terapias inovadoras. A proteína RamA, presente na espécie Klebsiella pneumoniae e noutros membros da família Enterobacteriaceae é um factor de transcrição com um papel na resistência a antibióticos e no controlo da virulência. A sobreexpressão desta proteína confere um fenótipo multiresistente aos microrganismos. Este projecto tem como objectivo compreender a influência de RamA no desenvolvimento de resistência a antibióticos e ao nível do metabolismo, através do estudo da sua regulação e expressão. Outro objectivo é compreender como actuam estes factores de transcrição como reguladores globais, afectando outras vias ou mecanismos não relacionados com a resistência a antibióticos e/ou virulência. O estudo da função do locus ram no panorama global da emergência de resistência aos antibióticos é de extrema importância visto que, ao contrário da maioria dos mecanismos de resistência, este processo não é quimicamente específico, mas sim uma resposta aos mais variados compostos. Estudar os compostos indutores deste locus e o seu impacto na expressão de ramA e ramR são muito importantes na compreensão do seu papel na adaptação das bactérias a novos ambientes e desafios. Numa primeira fase, foram identificados compostos que têm impacto no crescimento de estirpes mutantes isogénicas que sofreram deleções nos genes ramA e ramR. Para a identificação dos compostos procedeu-se à realização de “phenotypic microarrays” (PM), onde verificámos o impacto da delecção dos genes ramA e ramR no crescimento, sendo observado diferentes padrões de crescimento. Numa tentativa de reproduzir os resultados alcançados realizámos curvas de crescimento em meio apropriado, suplementado com compostos onde o crescimento de um mutante foi superior ao outro. O insucesso na reprodução dos resultados levou-nos a utilizar placas produzidas pelo mesmo fabricante dos PM e com um modus operandi semelhante mas específicas para bactérias gram-negativas, as placas GN. Alcançada a reprodução dos resultados com sucesso, foi necessário verificar qual dos genes, ramA ou ramR, era responsável pelos padrões de crescimento distintos. Estirpes recombinantes e respectivos controlos foram utilizadas para esse efeito. Os resultados acabaram por mostrar que o gene ramR parecia ter mais influência no metabolismo e crescimento do que o gene ramA, levando à formulação da hipótese de que o gene ramR poderia ter um papel de regulador global e não só de repressor local de ramA. Os resultados também indicaram que ramR parecia influenciar o metabolismo de açúcares e fontes de carbono, compostos estes que foram relatados como fazendo parte das cadeias biosintéticas de estruturas membranares na bactéria Escherichia coli. Estes novos dados e as observações de alterações fenotípicas nas estirpes recombinantes levaram-nos a considerar a hipótese de RamR poder controlar a expressão de estruturas membranares, como a membrana de lipopossacarídeos (LPS). No entanto, o estudo dos perfis de LPS das diferentes estirpes envolvidas neste trabalho não mostrou nenhuma diferença significativa entre elas, deixando aberta a possibilidade de realmente a camada de LPS não ser afectada de algum modo e serem outras estruturas membranares as responsáveis pelos fenótipos observados. Numa segunda fase testámos os efeitos de dois compostos, não presentes no PM, que se sabiam ter efeito sobre o locus ram no género Salmonella. Estes compostos, clorpromazina (CPZ) e indol, foram adicionados ao meio apropriado para a realização das curvas de crescimento. As curvas de crescimento na presença de CPZ não confirmaram ou contrariaram a literatura existente, obtendo resultados muito especulativos. A adição de indol ao meio nas curvas de crescimento não alterou de forma alguma o desenvolvimento das estirpes mutantes estudadas. Por meio de outros estudos sabe-se que estes dois compostos actuam de forma semelhante, a nível molecular, no locus ram de Salmonella e Klebsiella, mas isso não se reflecte ao nível do crescimento. Este estudo demonstra principalmente que o locus ram não é constítuido por apenas um regulador global, sugerindo a importância de ramR no crescimento e metabolismo bacteriano. Confirmando-se o envolvimento de RamR com diversas estruturas, responsáveis por características como a virulência ou patogenicidade, ganha-se um potencial alvo para novas terapias. O estudo do locus ram revela-se, assim, de extrema importância para compreender totalmente o seu envolvimento na aquisição da multiresistência por parte da bactéria K. pneumoniae e assim poder encontrar maneiras inovadoras de controlar um problema crescente para a saúde humana.