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Publication
Characterization of embryonic development of european cuttlefish (Sepia officinalis)
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 28.26 MB | Adobe PDF |
Advisor(s)
Abstract(s)
The increasing cephalopod human seeking as a source of food have been defined it as an
aquaculture candidate in the past 20 years. Such have been propelling the cephalopods
culturing, such of the European cuttlefish Sepia officinalis. However there are bottlenecks for
this species, for instance, at nutritional level. It has been difficult to define a diet with high
nutritional value for the cuttlefish and with reasonable costs for the producer. A variety of
alternative types of foods have been tried, but these have been showed to be costly and not as
good as natural diets. Artificial diets had been unsuccessful within the culturing of cuttlefish
This study aimed to characterize the development of digestive tract during embryogenesis of
European cuttlefish Sepia officinalis. The external and internal yolk sacs were mainly
focused, as well as their nutritional content (using specific stains) and function. Analysis at
macroscopical scale (weight and measurements) and microscopical scale (photographs,
histology and image analysis) was performed.
Eggs were weighed and measured in width and length. Then, these were cut open and
embryos were removed from capsule and photographed. The embryos were then kept in
formaldehyde. Images were treated and the area of the external yolk sac and the embryo was
measured using image J. Histological techniques were performed to characterize the different
embryonic stages and external and internal yolk sacs.
Changes in the eggs sizes were observed. An initial reduction of the weigh, width and length
during the first 10 dpp (days post posture) was observed. Followed by a rapid increase until
hatching (p < 0.001). A strong correlation between the weight and width of eggs (R2 = 0.92)
was observed. Being suggested as the most viable form of measurements for different studies.
The evolution of egg weight was compared with the study of Sykes, et al. (2009). Similar
variation was observed (P <0.05), however, in the present study the weight of the eggs was
higher. Females at the present study were bigger and laid larger eggs.
Both, external yolk sac and the embryo areas, measured with the image J were correlated. As
the external yolk sac decreased, and thus consumed, the embryo increased its size. During
embryonic development (from 12 day post posture, dpp) there was an inverse relationship
between these two factors (p < 0.001, R2 = 0.91).
The total area of the embryo (TEA, sum of the yolk sac area and embryo area) was estimated
and compared with the weight of the eggs during the same time period. TEA had an almost
linear evolution while the weight of the eggs was exponential during embryonic development. Despite the high correlation between these two factors (R2 = 0.68), it was suggested that the
water content may be also relevant in this period.
Different stages were identified according to the description of Naef (1928). Throughout
embryogenesis it was observed the development of various rudimentary organs, such as eyes,
arms and tentacles, mantle and its pigmentation. From stages X-XI onwards, the enclosure of
the external yolk sac was observed. From the 13 dpp onwards histological images were
collected and allowed a more detailed evolution of both yolk sacs. The contents of the sacs
were PAS positive, suggesting the presence of polysaccharides. The extra-ectoderm layer
(exe) was observed surrounding the external yolk sac, which was positive for Toluidine-O.
The outer side of this layer presented cilia that are responsible for molecules diffusion present
in the perivitelline fluid (pf). The inner side of the exe was in contact with the perivitelline
sinus (ps), which cells appeared to be absorbed or pinocytosis to the yolk sinus (ys). The sacs
content was composed of yolk platelets and empty spaces that may be related to the presence
of lipids. Similar spaces were also observed in the internal yolk sac but in this structure,
agglomeration of yolk droplets were mostly observed. Such droplets could be the early stages
of the digestive gland cells of the embryo. A darker layer around the internal yolk sac was
observed, which might be its epithelium, where it was noticed some triangular cells. It was
suggested that, similarly to other cephalopods, these cells could either be hemocytes reacting
to bacteria or either cellular replacement or detoxification. Near hatching, the animals showed
some resemblance with the adults and the external yolk sac was greatly reduced.
A procura por cefalópodes como fonte de alimento tem vindo a definir, nos últimos 20 anos, o seu potencial como candidatos para a aquacultura, propulsionando o cultivo de espécies como o choco (Sepia officinalis). Esta espécie apresenta um ciclo de vida curto e rápido crescimento, o que permite rápidos ciclos de produção a reduzido custo de manutenção. Têm altas taxas de sobrevivência e resistência a elevadas densidades e patologias. Contudo existem ainda alguns obstáculos à sua produção em grande escala, nomeadamente a nível nutricional. Apesar de diferentes tipos de alimentos terem sido testados em chocos, ainda não se definiu uma dieta com elevado valor nutricional e simultaneamente com custos reduzidos para o produtor. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento do trato digestivo durante a embriogénese de S. officinalis. Os sacos vitelinos externo e interno foram o foco principal desta dissertação, onde foi estudado não só o seu conteúdo nutricional (com recurso a colorações específicas), como também as suas funções. Foram realizadas análises a nível macroscópico (peso e medidas) e microscópico (fotografia, histologia e análise de imagem). Ao longo de 31 dias de amostragem, no Centro de Ciências do Mar (Estação Experimental do Ramalhete), foram recolhidos um total de 364 ovos de choco. Estes foram colocados em cestos de incubação, num tanque de 1500 L, com temperatura (19.4 ± 0.95 ºC), salinidade (34.5 ± 0.63 ‰) e oxigénio (93.7 ± 3.58 %) constantes. Foram recolhidos, aleatoriamente, 5 ovos por dia para pesagem e medição de largura e comprimento. Estes ovos foram abertos e cada embrião foi retirado da cápsula e córion, fotografado e de seguida preservado em formaldeído. Foi realizado o protocolo padrão de histologia para caracterizar os sacos vitelinos externo, interno e os diferentes estágios embrionários. Os chocos foram inicialmente desidratados através de lavagens em etanol de percentagens crescentes por períodos de tempo estabelecidos. Realizaram-se pré-infiltrações, infiltrações e polimerizações de acordo com as instruções em Heraeus Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmbH, Germany). Depois da solução de resina ter sido preparada, cerca de 3 ml foram colocado em moldes e os embriões cuidadosamente posicionados. Após 48 h de secagem, cortes longitudinais de 3 μm foram obtidos, colocados em lâminas de microscópio (3 a 5 cortes por lâmina) e corados com azul de tolueno e ácido periódico de Schiff (PAS – periodic acid-Schiff). Após a secagem, as lâminas foram observadas sob uma lupa Zeiss STEMI 2000-C e para maiores amplificações foi utilizado um microscópio Leica DM200 com câmara Leica SFC480 incorporada. As medições efetuadas permitiram detetar alterações no crescimento dos ovos. Foi observada uma redução inicial do peso, largura e comprimento durante os primeiros 10 dias após a postura (dpp - days post posture). Houve desidratação dos ovos endurecendo a cápsula gelatinosa exterior, o que permitiu a retenção dos nutrientes necessários ao desenvolvimento embrionário e ainda proteção contra agentes patológicos. De seguida, observou-se o aumento rápido das três variáveis (peso, largura e comprimento) até à eclosão (p < 0.001). A reabsorção de água facilitou a eclosão. Há uma maior correlação entre o peso e a largura dos ovos (R2 = 0.92) do que entre as restantes variáveis. O peso e a largura do ovo foram então sugeridas como as mais viáveis para diferentes estudos. O crescimento em peso dos ovos teve uma variação semelhante à obtida por Sykes, et al. (2009a) (p < 0.05), no entanto, o peso dos ovos apresentou valores superiores no presente estudo. Uma possível explicação é o facto de as fêmeas utilizadas neste estudo serem maiores, produzindo ovos de maiores dimensões. Fezse uma correlação entre a dimensão do saco vitelino externo e do embrião. O saco vitelino externo diminui à medida que foi consumido, o que se traduziu no aumento de tamanho do embrião. Assim, estas variáveis estão inversamente relacionadas (p < 0.001, R2 = 0.91). A área total do embrião (TEA – total embryo area, área do saco vitelino mais a área do embrião) foi estimada e comparada com o peso dos ovos durante o desenvolvimento embrionário. A TEA apresentou uma evolução quase linear, enquanto o peso dos ovos aumentou exponencialmente. Apesar de a correlação entre as duas variáveis ter sido elevada (R2 = 0.68), o teor de água poderá ser o aspeto mais relevante neste período. Os diferentes estágios de desenvolvimento embrionário foram identificados de acordo com a descrição de Naef (1928). Foi observado o desenvolvimento de órgãos rudimentares como olhos, braços e tentáculos, manto e sua pigmentação. A partir do estágio X-XI foi observada a inclusão do saco vitelino externo. De 13 dpp (estágio XIII-XIV) em diante, foi possível reunir imagens histológicas que permitiram uma observação detalhada de ambos os sacos vitelinos. Os conteúdos dos sacos tiveram resultados positivos para PAS, o que sugere a presença de polissacarídeos, enquanto que órgãos rudimentares e membranas dos sacos vitelinos tiveram resultados positivos para azul de tolueno. Foi observada a camada extra-ectodérmica (exe), positiva para tolueno. O lado exterior de exe é composto por cilia que é responsável pela difusão de moléculas presentes no fluido perivitelino. O lado interno de exe está em contato com o sinus perivitelino onde foram absorvidas e pinocitadas células para o sinus do vitelo. Os sacos eram constituídos por várias plaquetas de vitelo e por espaços, relacionados com a presença de lípidos. No saco vitelino interno foram também observados pontualmente os mesmos espaços, mas na maior parte dos casos foi observado um aglomerado de gotículas, que poderão ser fases iniciais de células da glândula digestiva do embrião. Foi observada uma camada mais escura em torno do saco vitelino interno, correspondendo possivelmente ao epitélio no qual existiam algumas células de formas triangulares. Estas células poderão advir do processo de substituição ou desintoxicação celular, ou poderão ser ainda hemócitos, que reagem à presença de bactérias, como observado anteriormente noutros cefalópodes. O volume do saco vitelino externo foi idêntico ao volume do embrião no fim do estágio XVI, podendo ser comparado com os resultados da correlação anteriormente efetuada entre a área do saco vitelino externo e a área do embrião. Nos estágios XVII-XVIII, o volume do saco vitelino externo e interno apresentaram semelhantes proporções. Próximo da eclosão os animais eram morfologicamente semelhantes aos adultos e o saco vitelino externo era bastante reduzido.
A procura por cefalópodes como fonte de alimento tem vindo a definir, nos últimos 20 anos, o seu potencial como candidatos para a aquacultura, propulsionando o cultivo de espécies como o choco (Sepia officinalis). Esta espécie apresenta um ciclo de vida curto e rápido crescimento, o que permite rápidos ciclos de produção a reduzido custo de manutenção. Têm altas taxas de sobrevivência e resistência a elevadas densidades e patologias. Contudo existem ainda alguns obstáculos à sua produção em grande escala, nomeadamente a nível nutricional. Apesar de diferentes tipos de alimentos terem sido testados em chocos, ainda não se definiu uma dieta com elevado valor nutricional e simultaneamente com custos reduzidos para o produtor. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o desenvolvimento do trato digestivo durante a embriogénese de S. officinalis. Os sacos vitelinos externo e interno foram o foco principal desta dissertação, onde foi estudado não só o seu conteúdo nutricional (com recurso a colorações específicas), como também as suas funções. Foram realizadas análises a nível macroscópico (peso e medidas) e microscópico (fotografia, histologia e análise de imagem). Ao longo de 31 dias de amostragem, no Centro de Ciências do Mar (Estação Experimental do Ramalhete), foram recolhidos um total de 364 ovos de choco. Estes foram colocados em cestos de incubação, num tanque de 1500 L, com temperatura (19.4 ± 0.95 ºC), salinidade (34.5 ± 0.63 ‰) e oxigénio (93.7 ± 3.58 %) constantes. Foram recolhidos, aleatoriamente, 5 ovos por dia para pesagem e medição de largura e comprimento. Estes ovos foram abertos e cada embrião foi retirado da cápsula e córion, fotografado e de seguida preservado em formaldeído. Foi realizado o protocolo padrão de histologia para caracterizar os sacos vitelinos externo, interno e os diferentes estágios embrionários. Os chocos foram inicialmente desidratados através de lavagens em etanol de percentagens crescentes por períodos de tempo estabelecidos. Realizaram-se pré-infiltrações, infiltrações e polimerizações de acordo com as instruções em Heraeus Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmbH, Germany). Depois da solução de resina ter sido preparada, cerca de 3 ml foram colocado em moldes e os embriões cuidadosamente posicionados. Após 48 h de secagem, cortes longitudinais de 3 μm foram obtidos, colocados em lâminas de microscópio (3 a 5 cortes por lâmina) e corados com azul de tolueno e ácido periódico de Schiff (PAS – periodic acid-Schiff). Após a secagem, as lâminas foram observadas sob uma lupa Zeiss STEMI 2000-C e para maiores amplificações foi utilizado um microscópio Leica DM200 com câmara Leica SFC480 incorporada. As medições efetuadas permitiram detetar alterações no crescimento dos ovos. Foi observada uma redução inicial do peso, largura e comprimento durante os primeiros 10 dias após a postura (dpp - days post posture). Houve desidratação dos ovos endurecendo a cápsula gelatinosa exterior, o que permitiu a retenção dos nutrientes necessários ao desenvolvimento embrionário e ainda proteção contra agentes patológicos. De seguida, observou-se o aumento rápido das três variáveis (peso, largura e comprimento) até à eclosão (p < 0.001). A reabsorção de água facilitou a eclosão. Há uma maior correlação entre o peso e a largura dos ovos (R2 = 0.92) do que entre as restantes variáveis. O peso e a largura do ovo foram então sugeridas como as mais viáveis para diferentes estudos. O crescimento em peso dos ovos teve uma variação semelhante à obtida por Sykes, et al. (2009a) (p < 0.05), no entanto, o peso dos ovos apresentou valores superiores no presente estudo. Uma possível explicação é o facto de as fêmeas utilizadas neste estudo serem maiores, produzindo ovos de maiores dimensões. Fezse uma correlação entre a dimensão do saco vitelino externo e do embrião. O saco vitelino externo diminui à medida que foi consumido, o que se traduziu no aumento de tamanho do embrião. Assim, estas variáveis estão inversamente relacionadas (p < 0.001, R2 = 0.91). A área total do embrião (TEA – total embryo area, área do saco vitelino mais a área do embrião) foi estimada e comparada com o peso dos ovos durante o desenvolvimento embrionário. A TEA apresentou uma evolução quase linear, enquanto o peso dos ovos aumentou exponencialmente. Apesar de a correlação entre as duas variáveis ter sido elevada (R2 = 0.68), o teor de água poderá ser o aspeto mais relevante neste período. Os diferentes estágios de desenvolvimento embrionário foram identificados de acordo com a descrição de Naef (1928). Foi observado o desenvolvimento de órgãos rudimentares como olhos, braços e tentáculos, manto e sua pigmentação. A partir do estágio X-XI foi observada a inclusão do saco vitelino externo. De 13 dpp (estágio XIII-XIV) em diante, foi possível reunir imagens histológicas que permitiram uma observação detalhada de ambos os sacos vitelinos. Os conteúdos dos sacos tiveram resultados positivos para PAS, o que sugere a presença de polissacarídeos, enquanto que órgãos rudimentares e membranas dos sacos vitelinos tiveram resultados positivos para azul de tolueno. Foi observada a camada extra-ectodérmica (exe), positiva para tolueno. O lado exterior de exe é composto por cilia que é responsável pela difusão de moléculas presentes no fluido perivitelino. O lado interno de exe está em contato com o sinus perivitelino onde foram absorvidas e pinocitadas células para o sinus do vitelo. Os sacos eram constituídos por várias plaquetas de vitelo e por espaços, relacionados com a presença de lípidos. No saco vitelino interno foram também observados pontualmente os mesmos espaços, mas na maior parte dos casos foi observado um aglomerado de gotículas, que poderão ser fases iniciais de células da glândula digestiva do embrião. Foi observada uma camada mais escura em torno do saco vitelino interno, correspondendo possivelmente ao epitélio no qual existiam algumas células de formas triangulares. Estas células poderão advir do processo de substituição ou desintoxicação celular, ou poderão ser ainda hemócitos, que reagem à presença de bactérias, como observado anteriormente noutros cefalópodes. O volume do saco vitelino externo foi idêntico ao volume do embrião no fim do estágio XVI, podendo ser comparado com os resultados da correlação anteriormente efetuada entre a área do saco vitelino externo e a área do embrião. Nos estágios XVII-XVIII, o volume do saco vitelino externo e interno apresentaram semelhantes proporções. Próximo da eclosão os animais eram morfologicamente semelhantes aos adultos e o saco vitelino externo era bastante reduzido.
Description
Dissertação de mestrado, Aquacultura e Pescas (Aquacultura), Faculdade de Economia, Universidade do Algarve, 2014
Keywords
Aquacultura Chocos Sepia officinalis Embriologia Histologia