Publication
Diversity of cultured heterotrophic bacteria from polar sea waters and sea ice ecosystems: A unique source for blue biotechnology
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais | |
| dc.contributor.advisor | Power, Deborah M. | |
| dc.contributor.advisor | Acinas, Silvia G. | |
| dc.contributor.author | Tinto, Eleonora | |
| dc.date.accessioned | 2024-07-17T09:25:27Z | |
| dc.date.available | 2024-07-17T09:25:27Z | |
| dc.date.issued | 2023-12-01 | |
| dc.description.abstract | The discovery of the CRISPR-Cas system, a prokaryotic defense mechanism, has revolutionized genomics and biotechnology. This system uses Cas nucleases to precisely cut DNA sequences by relying on a protospacer adjacent motif (PAM). Cas9, especially SpCas9 from Streptococcus pyogenes, has been widely studied for genome engineering due to its wellunderstood biochemistry and short PAM sequence. However, its limitations in the recognition of PAM sequences have led researchers to look for natural orthologs of Cas9. This study focuses on the remote areas of the polar regions, where extreme conditions result in unique environments. During three expeditions - PI-ICE (2019) and ANTOM-2 (2022) in Antarctica, and QikIce in the Arctic (2023) – seawater, sea ice and brine samples were collected. Subsequent cultivation showed differences in bacterial growth and taxa enrichment between seawater and sea ice heterotrophic bacteria. Furthermore, the taxonomic analysis of 199 colonies revealed similarities and variations in their biodiversity across habitats, depths and regions. In particular, in ANTOM-2, seawater samples from different depths showed a prevalence of Gammaproteobacteria in deeper layers, while Alphaproteobacteria dominated the photic zones. Dominant genera included Sulfitobacter, Pseudoalteromonas and Shewanella. Five out of seven deep-sea genera were found in photic zones, including Bacillus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychroserpens and Winogradskyella. In contrast, sea ice isolates from PI-ICE showed an absence of Alphaproteobacteria, with Flavobacteriia and Gammaproteobacteria dominating. Notable genera were Flavobacterium, Psychrobacter and Chryseobacterium. During the QikIce expedition, Bacilli and Flavobacteriia were predominant, while three genera differed from those found in Antarctica: Planomicrobium, Maribacter and Octadecabacter. In the final phase of the study, the design of two primer pairs led to the amplification of potential Cas9 sequences from three Flavobacterium isolates, opening up new avenues for future efforts. This research highlights the importance of exploring extreme environments, such as polar regions, for biotechnological discoveries and expanding the CRISPR-Cas toolbox. | eng |
| dc.description.abstract | A descoberta do sistema CRISPR-Cas, um mecanismo de defesa para procariotas, revolucionou rapidamente o mundo da biologia, biotecnologia e biomedicina. Essa tecnologia particular de edição genómica utiliza a capacidade de uma família de proteínas, chamadas nucleases Cas, para cortar o genoma em sequências de nucleotídeos específicas. Esta clivagem é possível somente quando uma sequência de reconhecimento PAM (Motivo Adjacente ao Protospacer) está presente antes do local de edição, garantindo, também, que o DNA autêntico não seja danificado. Em particular, a Cas9 foi estudada para engenharia genómica muito mais do que qualquer outra proteína pertencente à família Cas, especialmente a SpCas9, descoberta em Streptococcus pyogenes. Isso deve-se à sua bioquímica bem conhecida e à presença de uma breve sequência PAM. Apesar de anos de estudo e otimização, a Cas9 apresenta limitações relacionadas ao reconhecimento das sequências PAM, exigindo uma seleção cuidadosa do local, para evitarligações e clivagens indesejadas. Para superar estas limitações, os investigadores estão a explorar ativamente novos ortólogos de Cas9 que ocorrem naturalmente. Esta investigação está em constante crescimento, em paralelo com a exploração da biodiversidade marinha. Este estudo faz parte desta investigação, com foco num ambiente extremo e único: as regiões polares. Durante este projeto, bactérias foram cultivadas a partir de um total de 33 amostras coletadas em três diferentes expedições polares. A primeira expedição, chamada PI-ICE, ocorreu na Antártida de 4 de fevereiro a 11 de março de 2019. Foram consideradas duas amostras de gelo marinho, coletadas perto à entrada do Mar de Weddell, através do Estreito de Bransfield. A segunda expedição, conhecida como ANTOM-2, teve lugar de 27 de janeiro a 5 de fevereiro de 2022. Durante esta expedição, foram recolhidas amostras de água do mar a diferentes profundidades, em cinco estações ao longo da costa ocidental da Península Antárctica. No total, foram analisadas 25 amostras, incluindo 12 amostras de estratos fóticos, 10 de estratos mesopelágicos e 3 de estratos batipelágicos. A terceira e mais recente expedição, denominada QikIce, teve lugar no Ártico de 22 a 25 de abril de 2023. Em particular, foram recolhidas seis amostras de diferentes fontes: uma do mar, três de secções de gelo marinho e duas de salmoura. Estas amostras foram recolhidas a sudoeste de Qikiqtarjuaq, também conhecida como Ilha de Broughton. Durante o nosso estudo, observámos diferenças significativas na capacidade de cultivo entre as amostras de água do mar recolhidas durante a expedição ANTOM-2 e as amostras de gelo marinho recolhidas durante a expedição PI-ICE. Utilizámos meios de cultura padrão para o cultivo. As bactérias das amostras de água do mar foram cultivadas em meios ricos em nutrientes constituídos por caldo marinho e ágar, enquanto as das amostras de gelo marinho foram cultivadas num meio pobre em nutrientes chamado R2A. Em particular, as amostras de água do mar apresentaram um crescimento limitado das colónias, enquanto que as amostras de gelo marinho apresentaram um crescimento abundante. Além disso, as bactérias recolhidas na água do mar de diferentes profundidades apresentaram variações significativas. Em geral, o número de unidades formadoras de colónias (CFU/ml) tendeu a diminuir à medida que se passava das zonas fóticas para as zonas mais profundas. Foi selecionado um total de 199 colónias das três expedições, 119 da expedição ANTOM-2, 64 da expedição PI-ICE e 16 da expedição QuikIce. Posteriormente, as células foram lisadas e as sequências do gene 16S rRNA foram amplificadas, utilizando os iniciadores específicos para bactérias 358F e 907R. Após verificação da qualidade dos produtos de PCR por eletroforese em gel, procedeu-se à sequenciação. Uma vez obtidas as sequências purificadas das estirpes isoladas, a taxonomia de cada uma foi determinada por comparação com as sequências bacterianas na base de dados SILVA rRNA. Os resultados taxonómicos revelaram que, na expedição ANTOM-2, a classe Gammaproteobacteria dominou nas camadas profundas, enquanto a classe Alphaproteobacteria foi predominante nas zonas fóticas. Os três géneros mais comuns entre os isolados desta expedição foram Sulfitobacter, Pseudoalteromonas e Shewanella. Além disso, cinco dos sete géneros identificados nas águas profundas também estavam presentes nas zonas fóticas, incluindo Bacillus, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychroserpens e Winogradskyella. Em comparação com os resultados obtidos a partir dos isolados de gelo marinho recolhidos na expedição PI-ICE, a classe Alphaproteobacteria esteve ausente, enquanto as classes predominantes foram Flavobacteria e Gammaproteobacteria. Em termos de géneros, os mais abundantes foram Flavobacterium e Psychrobacter, seguidos de Chryseobacterium. Na expedição QikIce, embora o número de colónias isoladas fosse limitado, foram identificadas diferenças taxonómicas em comparação com as expedições antárcticas. As classes mais abundantes foram Bacilli e Flavobacteriia. Em termos de géneros, foram encontrados três géneros que não foram observados nas outras duas expedições. Por ordem de abundância, estes foram Planomicrobium, Maribacter e Octadecabacter. Posteriormente, para determinar a possível relação filogenética entre os nossos isolados, as sequências foram alinhadas utilizando o programa bioinformático MEGA11 (Molecular Evolution Genetics). Os dados obtidos foram utilizados para construir a árvore filogenética utilizando o método Neighbour-Joining (NJ). Em particular, foram identificadas algumas ligações entre isolados de diferentes habitats e regiões polares. No que diz respeito aos isolados da Antárctida, alguns dos géneros Flavobacterium e Pseudomonas da água do mar apresentaram agrupamentos independentes com isolados dos mesmos géneros do gelo marinho. Foi também encontrada uma semelhança entre os isolados do género Planomicrobium da água e do gelo marinho do Ártico. Além disso, foi encontrada uma ligação entre os isolados de água do mar do Antártico dos géneros Psychroserpens e Bacillus e os seus homólogos encontrados no gelo marinho do Ártico. Por fim, foram concebidos primers específicos para amplificar potenciais genes Cas9 presentes no ADN extraído de certos isolados, pertencentes ao género Flavobacterium de amostras de gelo e de água do mar da Antárctida. O primeiro par de primers foi concebido utilizando como modelo as sequências Cas9 de F. frigidarium e F. psychrophilum, identificadas com o programa CRISPR-CasFinder, com o objetivo de amplificar uma sequência de aproximadamente 1600 pb. O segundo par de primers foi concebido com base na sequência Cas9 de F. pectinovorum, com o objetivo de amplificar uma sequência de aproximadamente 1100 pb. Os dados da amplificação indicaram a possível presença dos genes Cas9 em dois isolados de gelo marinho. Em particular, os produtos de PCR analisados em géis mostraram a presença de duas bandas individuais ténues de cerca de 1000 e 1500 pb. Além disso, outro isolado apresentou uma única banda mais espessa e claramente visível de cerca de 500 pb, que poderia representar um fragmento mais curto.Os resultados preliminares deste estudo revelaram semelhanças e variações na biodiversidade de bactérias heterotróficas em diferentes ambientes, profundidades e regiões polares. Em particular, foram identificadas bactérias que são atualmente de grande interesse para a investigação em biotecnologia azul. Além disso, a descoberta da presença de sequências que contêm o gene Cas9 constitui um ponto de partida para futuras investigações. A integração de dados metagenómicos poderia enriquecer ainda mais esta informação, permitindo uma maior precisão e eficiência no estudo da presença e função dos genes Cas9 em ambientes polares. Este estudo sublinha a importância crucial da exploração de ambientes extremos, como as regiões polares, para conduzir descobertas no campo da biotecnologia e expandir o conjunto de instrumentos relacionados com o CRISPR-Cas. | por |
| dc.identifier.tid | 203551931 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/25646 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.title | Diversity of cultured heterotrophic bacteria from polar sea waters and sea ice ecosystems: A unique source for blue biotechnology | eng |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biologia Marinha |