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Optimization of the production of fucoxanthin-rich fractions from the microalga Isochrysis galbana
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As microalgas são organismos microscópicos uni- ou multicelulares com a habilidade de converterem energia solar em energia química num processo conhecido por fotossíntese. Estes seres vivos autotróficos sintetizam ácidos gordos polinsaturados (PUFA) como os acidos eicosapentoenoico (EPA) ou docosahexaenoico (DHA) conhecidos pelas suas aplicações terapêuticas em ensaios clínicos como agentes antioxidantes, anticancerígenos ou no combate à obesidade. Apesar dos benefícios conhecidos do EPA e DHA os seres humanos e outros vertebrados como os peixes não têm capacidade para os sintetizarem e por isso existe uma grande necessidade de encontrar novas fontes sustentáveis destes compostos de maneira a aliviar a pressão sobre os stocks de pesca continuando a dar resposta a um mercado em crescimento. As microalgas utilizam a sua pigmentação não só como forma de capturarem a luz solar, mas também, como uma ferramenta no combate ao stress oxidativo. O pigmento em destaque nesta tese é a fucoxantina, uma xantofila com capacidade para desempenhar as duas funções acima descritas dependendo da espécie de microalga. As bioactividades associadas à fucoxantina fazem com que seja alvo de inúmeros ensaios clínicos demonstrando ser não só um poderoso agente antioxidante bem como um promissor agente no combate a inflamações, diabetes e obesidade, tendo por isso tem um valor de mercado acrescido uma vez que pode ser utilizado em diversas áreas com implicações muito revelantes na saúde humana. A variabilidade da biomassa de microalgas atraiu nos últimos anos inúmeras indústrias que vêm nestes seres vivos a solução para diversos problemas como: a redução de CO2 atmosférico; uma fonte sustentável de biodiesel devido ao alto nível lipídico de algumas espécies; uma nova fonte promissora de proteína ou o potencial para isolar novas moléculas com relevância nas áreas das ciências biomédicas, nas indústrias cosméticas ou farmacêuticas. Na última década a União Europeia tem reunido esforços e financiado projectos nas mais diversas áreas de caracterização de microalgas sendo promotora da aprovação das espécies Chlorella e Tetraselmis para consumo humano. O desafio prende-se agora com o estabelecimento de protocolos universais que permitam aos diversos países da UE comparar resultados e criar novos consensos levando à regulamentação de cada sector e de um mercado global em crescimento. Assim sendo, a microalga haptofita Isochrysis galbana foi escolhida com base no seu perfil bioquímico como uma fonte promissora para fucoxantina, um carotenoide com elevada actividade antioxidante e DHA. Nas instalações da Necton, os ALGEM® environmental labscale photobioreactors foram usados para averiguar quais as melhores condições de crescimento celular da cultura bem como de acumulação de fucoxantina e DHA. Estes reactores permitem submeter as culturas às condições abióticas desejáveis tendo a capacidade de simular: fotoperíodo, intensidade luminosa (LED), temperatura e agitação. Os ensaios nos reactores ALGEM® revelaram que a estação do ano com maior acumulação de fucoxantina foi o Outono (6.4 ± 0.1 mg/g peso seco) e que o pH mais propicio para a bioacumulação deste carotenoide é pH 7.5 (7.88 ± 0.05 mg/g peso seco). O perfil de ácidos gordos realizado no GC-MS identificou a estação do ano Outono e o pH 8.5 como aqueles que produziram maiores níveis de DHA com 11.9 % e 16.7 % do total de ácidos gordos, respectivamente. A biomassa produzida nos reactores tubulares da Necton continha 17.69 ± 1.06 mg/g peso seco de fucoxantina e foi usada para identificar o melhor método de extracção testando as condições: rácio de biomassa/solvente e tempo de extracção. Os resultados identificaram a proporção 1/2 (10g biomassa humida/ 20 mL etanol) com 1 hora de agitação como a melhor para extrair fucoxantina. Com base neste resultado, vários extractos foram preparados para testar a extracção líquido-líquido (LTPS) na recolha de fucoxantina e DHA. Esta nova técnica permite o fracionamento de um extracto de microalgas separando compostos de elevado valor como o DHA, a fucoxantina e outros ácidos gordos, por isso a eficácia da técnica foi averiguada testando diferentes proporções de hexano e água (H/W: 1/2, 1/1, 2/1) e quantificando a quantidade de fucoxantina e DHA em cada sistema. O LTPS demonstrou ser uma técnica apropriada para a extração destes compostos, com o ratio 2/1 (160/80, H/W) a extrair mais fucoxantina, enquanto a maior quantidade de DHA foi recolhida no sistema 1/1 (120/120, H/W). Por estas razões, conclui-se que o sistema de solventes mais promissor para o LTPS foi o ratio 1/1 (H/W) assumindo a combinação de critérios: quantidade de fucoxantina; quantidade de DHA; peso da fração coloidal. Idealmente, o melhor sistema de solventes será aquele que conseguirá extrair a maior quantidade de fucoxantina sem comprometer significativamente a quantidade de DHA e de fase coloidal. Novos ensaios serão preparados para testar esta e outras condições capazes de influenciar a dinâmica das emulsões.
Microalgae are microscopic unicellular and multicellular organisms capable of harvesting sunlight and convert it to chemical energy in a process known as photosynthesis. These photoautotrophs synthesize PUFA, including eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids known for their therapeutic applications such as antioxidant, anti-cancer or anti-obesity effects. Despite the benefits of these molecules, humans and other vertebrates like fish lack the metabolic pathways to be able to biosynthesize them, therefore, there is an urgent need to find new sustainable sources for antioxidant agents, DHA and other essential PUFAs. The haptophyte Isochrysis galbana was chosen based on its biochemical profile, as a promising new feedstock for fucoxanthin and DHA. In Necton facilities, the ALGEM® environmental labscale photobioreactors were used to assess the ideal abiotic conditions for the cultivation of I.galbana and its intracellular accumulation of fuoxanthin and DHA. The ALGEM® annual variation trial revealed a significant higher bioaccumulation of fucoxanthin during Autumn season while the pH trial identified the highest value of fucoxanthin at pH 7.5 (7.88 mg/g DW). The fatty acid profile analysis of each Algem® trial identified Autumn season and pH 8.5 as the ones accumulating more DHA, 11.9 % TFA and 16.7 % TFA, respectively. The biomass from the tubular photobioreactors contained 17.69 ± 1.06 mg/g DW of fucoxanthin and it was used to identify the best extraction conditions focusing on: biomass/solvent ratio and time of extraction. The results identified the proportion 1/2 (10g WB/ 20 mL ethanol) at 1 hour mixing as the best for the extraction of fucoxanthin. Several extracts were prepared in this way to test the efficiency of the LTPS in extracting fucoxanthin as well as DHA. This novel liquid-liquid extraction system allows to fractionate a microalgae extract effectively separating high-value compounds such as fucoxanthin, DHA and other PUFA, therefore, the efficiency of LTPS was assessed by testing different solvent systems using hexane and water (H/W: 1/2, 1/1, 2/1) and quantifying the amount of DHA and fucoxanthin in each fraction of all solvent systems. The LTPS revealed to be a suitable technique with the solvent system 2/1 (160,80 H/W) being the one that extracted more fucoxanthin, while the majority of DHA was collected in the ratio 1/1 (120/120, H/W). For these reasons, the best LTPS solvent system was selected based on a combination of the following criteria: quantity of fucoxanthin; amount of DHA and yield of colloidal fraction. The most promising solvent system was considered to be the ratio 1/1 (H/W). Despite that, new trials are being study aiming to determine a solvent proportion that extracts the highest possible amount of fucoxanthin without significantly compromise the DHA content and the amount of colloidal fraction. Although more trials should be performed, this work revealed to be an important step towards the confirmation of the LTPS technique as a promising protocol for a biorefinery concept.
Microalgae are microscopic unicellular and multicellular organisms capable of harvesting sunlight and convert it to chemical energy in a process known as photosynthesis. These photoautotrophs synthesize PUFA, including eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids known for their therapeutic applications such as antioxidant, anti-cancer or anti-obesity effects. Despite the benefits of these molecules, humans and other vertebrates like fish lack the metabolic pathways to be able to biosynthesize them, therefore, there is an urgent need to find new sustainable sources for antioxidant agents, DHA and other essential PUFAs. The haptophyte Isochrysis galbana was chosen based on its biochemical profile, as a promising new feedstock for fucoxanthin and DHA. In Necton facilities, the ALGEM® environmental labscale photobioreactors were used to assess the ideal abiotic conditions for the cultivation of I.galbana and its intracellular accumulation of fuoxanthin and DHA. The ALGEM® annual variation trial revealed a significant higher bioaccumulation of fucoxanthin during Autumn season while the pH trial identified the highest value of fucoxanthin at pH 7.5 (7.88 mg/g DW). The fatty acid profile analysis of each Algem® trial identified Autumn season and pH 8.5 as the ones accumulating more DHA, 11.9 % TFA and 16.7 % TFA, respectively. The biomass from the tubular photobioreactors contained 17.69 ± 1.06 mg/g DW of fucoxanthin and it was used to identify the best extraction conditions focusing on: biomass/solvent ratio and time of extraction. The results identified the proportion 1/2 (10g WB/ 20 mL ethanol) at 1 hour mixing as the best for the extraction of fucoxanthin. Several extracts were prepared in this way to test the efficiency of the LTPS in extracting fucoxanthin as well as DHA. This novel liquid-liquid extraction system allows to fractionate a microalgae extract effectively separating high-value compounds such as fucoxanthin, DHA and other PUFA, therefore, the efficiency of LTPS was assessed by testing different solvent systems using hexane and water (H/W: 1/2, 1/1, 2/1) and quantifying the amount of DHA and fucoxanthin in each fraction of all solvent systems. The LTPS revealed to be a suitable technique with the solvent system 2/1 (160,80 H/W) being the one that extracted more fucoxanthin, while the majority of DHA was collected in the ratio 1/1 (120/120, H/W). For these reasons, the best LTPS solvent system was selected based on a combination of the following criteria: quantity of fucoxanthin; amount of DHA and yield of colloidal fraction. The most promising solvent system was considered to be the ratio 1/1 (H/W). Despite that, new trials are being study aiming to determine a solvent proportion that extracts the highest possible amount of fucoxanthin without significantly compromise the DHA content and the amount of colloidal fraction. Although more trials should be performed, this work revealed to be an important step towards the confirmation of the LTPS technique as a promising protocol for a biorefinery concept.
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Keywords
Microalgae Extract Isochrysis galbana Fucoxanthin DHA PUFA