Development of polysaccharide-based carriers for pulmonary tuberculosis therapy

Rodrigues, Susana Isabel Guerreiro

http://hdl.handle.net/10400.1/13633

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Susana Rodrigues_a28151 PhD thesis 2019.pdf		3.86 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Rodrigues, Susana Isabel Guerreiro

Advisor(s)

Grenha, Ana

Abstract(s)

A tuberculose é uma doença infeciosa provocada pelo Mycobacterium tuberculosis. A transmissão da bactéria ocorre por via inalatória, após o que a mesma se aloja nos macrófagos existentes na região alveolar. A bactéria tem a capacidade de sobreviver e multiplicar-se mesmo depois de fagocitada pelos macrófagos alveolares, podendo ficar em estado latente por vários meses e até anos. Apesar de existir uma vacina contra a doença, a denominada BCG, de Bacillus Calmette-Guérin, esta não é totalmente eficaz e muitas pessoas desenvolvem a doença apesar de imunizadas. A tuberculose continua a ser a principal causa de morte evitável a nível mundial e está a reaparecer na Europa, estando muito associada aos casos de co-morbilidade com o vírus da imunodeficiência humana (VIH). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a terapia da tuberculose é obrigatoriamente combinada, para potenciar a eficácia do tratamento. Neste contexto, a isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB) são dois dos fármacos de primeira linha utilizados, a última usada particularmente nos casos em que o doente apresenta também infeção por VIH. Estas moléculas apresentam características diferentes, nomeadamente em termos de massa molecular e afinidade aquosa. A INH é uma molécula hidrofílica com 137 g/mol, enquanto a RFB tem 847 g/mol e é hidrofóbica, exigindo solventes orgânicos ou soluções ácidas para dissolver. Considerando a tuberculose pulmonar como a principal manifestação da doença, a administração direta de antibióticos ao pulmão e, particularmente, aos alvéolos, onde residem os macrófagos que atuam como hospedeiros da bactéria, compreende uma abordagem muito promissora, permitindo a entrega de fármacos no local primário da infeção. Esta estratégia implica o desenvolvimento de formulações para inalação, requerendo o uso de transportadores de fármacos que exibam propriedades aerodinâmicas adequadas para alcançar a região alveolar, onde residem os macrófagos que podem, assim, internalizar os fármacos. A literatura mostra que, para alcançar esta zona do pulmão, os transportadores devem ter um diâmetro aerodinâmico entre 1 e 5 μm. Na realidade, devido à geometria dos pulmões, as partículas a utilizar como transportadores precisam de ter um tamanho suficientemente pequeno para entrar nas vias aéreas inferiores, mas a sua massa deve ser suficiente para impedir que sejam exaladas juntamente com o ar expirado, o que justifica o intervalo de diâmetros referido anteriormente e a frequente utilização de micropartículas para inalação. A opção pela utilização de transportadores como veículos dos fármacos requer também que a matriz constituinte das partículas seja o mais inerte possível, não induzindo toxicidade ou reações de inflamação. Neste sentido, os materiais de origem natural e, particularmente, os polímeros como os polissacáridos, são reportados como tendo maior probabilidade de exibir biocompatibilidade e biodegradabilidade, duas características essenciais para uma aplicação na área da administração de fármacos. Considerando que o agente patogénico se aloja nos macrófagos alveolares, os fármacos devem alcançar este compartimento intracelular antes de ocorrer a sua libertação a partir do transportador inalado, o que ficará facilitado pela internalização dos próprios transportadores pelas células. Para melhorar este processo de internalização, alguns trabalhos reportam a funcionalização da superfície das partículas com ligandos que são reconhecidos pelos recetores dos macrófagos. Alguns polímeros naturais apresentam uma importante vantagem a esse respeito, sendo compostos por unidades estruturais que são reconhecidas diretamente por vários recetores dos macrófagos. O sulfato de condroitina (ChS) e a k-carragenina (CRG) são dois exemplos desses polímeros naturais. O primeiro é composto por unidades alternadas de N-acetilgalactosamina e ácido glucurónico, enquanto o último contém resíduos de galactose-4-sulfato e galactose anidra. Ambos estão reportados como sendo reconhecidos especificamente pelos macrófagos, bem como por proporcionarem a ativação destas células. Neste trabalho, foram produzidas micropartículas por um processo de atomização, as quais contêm os fármacos modelo (INH e RFB) de forma combinada, respeitando assim as indicações da Organização Mundial da Saúde. Os fármacos foram sempre associados às micropartículas numa razão de massa polímero/INH/RFB de 10/1/0.5. À formulação produzida com CRG, adicionou-se um outro polímero de matriz de forma a mitigar o potencial inflamatório que tem sido reportado para a CRG na literatura. As micropartículas foram, neste caso, preparadas com uma relação de massa de amido/CRG de 8/2. Esta formulação obteve um rendimento de produção de 70% e associou efetivamente 96% da INH e 74% da RFB. Ao analisar o diâmetro aerodinâmico foi verificado que este variou entre 3.3 μm e 3.9 μm e obteve-se uma percentagem de partículas finas de 32% - 38%. Estes valores seriam satisfatórios não fosse a deposição de aproximadamente 50% das partículas na zona correspondente à garganta. Por esse motivo, identificou-se a necessidade de aperfeiçoamento desta formulação para utilização futura. Por outro lado, para as micropartículas compostas por ChS como material de matriz, foram testados dois solventes (etanol e ácido clorídrico) para solubilização da RFB, avaliando-se qual dos dois conduz à obtenção de partículas com melhores características. Ambas as formulações evidenciaram micropartículas de forma esférica, com uma superfície tendencialmente mais rugosa após a associação dos fármacos. Os rendimentos de produção foram bastante satisfatórios, na ordem dos 80%, e os fármacos foram associados com eficácia de 95% para INH e 59-69% para RFB. Apesar de ambas as formulações apresentarem diâmetros aerodinâmicos semelhantes (3.8 – 4.0 μm), as micropartículas produzidas com etanol demonstraram melhores resultados, registando uma maior percentagem de partículas finas (43% contra 35% nas micropartículas preparadas com HCl), o que reflete melhor capacidade para alcançar a região respiratória e uma maior dose de fármaco contida na fração de partículas finas que alcançarão a zona alveolar. Acresce que esta formulação permitiu ainda maior controlo sobre a libertação dos fármacos associados, nomeadamente da RFB. Desta forma, a formulação de micropartículas em que o etanol foi utilizado como solvente, foi selecionada para prosseguir os ensaios de biocompatibilidade em células. Na formulação de micropartículas com matriz à base de amido/CRG não foi possível testar a utilização de etanol, uma vez que o protocolo de preparação implica o recurso a um banho de água quente durante o processo de atomização, o qual levaria à evaporação do solvente. Assim se justifica que essas micropartículas tenham sido produzidas unicamente com ácido clorídrico como co-solvente. A atividade inibitória dos fármacos modelo contra a M. bovis BCG foi mantida após o processo de microencapsulação por atomização em todas as formulações, independentemente dos materiais de matriz e dos solventes utilizados, o que indica a adequação do método de produção das micropartículas. Por forma a avaliar o perfil de citotoxicidade das micropartículas desenvolvidas, foram realizados ensaios em diferentes linhas celulares humanas, variando concentrações e tempos de exposição (até 24 h). As micropartículas foram testadas em células epiteliais alveolares (A549) e em macrófagos derivados de monócitos (dTHP-1), ambos de grande relevância no contexto da tuberculose pulmonar. Verificou-se que as micropartículas compostas por amido/CRG podem apresentar algumas limitações, com algum nível de toxicidade indesejável, ao contrário das micropartículas com matriz de ChS, que mantiveram os níveis de viabilidade celular acima de 70% em todas as condições testadas. Os macrófagos derivados de monócitos foram ainda utilizados para testar quer a capacidade das células para capturar as micropartículas, quer a capacidade das últimas para induzir a ativação dos macrófagos. O ensaio de captura macrofágica demonstrou que, em comparação, as micropartículas de ChS conseguem um maior nível de internalização para um tempo de exposição e uma dose semelhante. Por outro lado, a produção de interleucinas (TNF-α e IL-8) pelas células foi mais pronunciada após contacto com as micropartículas de amido/CRG, indicando uma maior apetência destas para ativar os macrófagos mesmo a concentrações mais baixas. Considerando os bons resultados obtidos com as micropartículas com matriz de ChS, a avaliação do seu perfil toxicológico foi aprofundada por meio da realização de um estudo multiparamétrico, o qual recorreu à utilização de macrófagos de ratinho (células J774A.1). O estudo envolveu a incubação das células com concentrações não tóxicas dos materiais, realizando-se posteriormente, por microscopia de fluorescência, uma análise de conteúdos específicos que indicam a resposta celular. Os parâmeros analisados foram a atividade mitocondrial, a área da célula, a área do núcleo, a permeabilidade da membrana, o conteúdo de fosfolípidos (fosfolipidose) e o conteúdo de lípidos neutros (esteatose). Após incubação com as micropartículas de ChS (produzidas com etanol), não foi verificada nenhuma alteração nos parâmetros estudados. Apenas para a RFB na forma livre se verificou uma alteração da quantidade de fosfolípidos existentes quando comparado com o controlo de células não expostas. Contudo, estas alterações apenas se verificaram em concentrações de fármaco muito mais elevadas do que as presentes nas micropartículas, pelo que se acredita que a níveis terapêuticos não ocorrerão as alterações verificadas, o que foi sugerido também quando se testaram as micropartículas com fármaco. Foi realizado também um estudo preliminar in vivo em ratinhos BALB/c, no qual os animais foram expostos a micropartículas sem fármaco. Devido ao facto dos materiais de matriz utilizados neste trabalho, o sulfato de condroitina e o amido/CRG, não terem utilização reportada para via inalatória, considerou-se relevante fazer uma análise preliminar da resposta dos animais ao contacto com os mesmos. Foram testadas as micropartículas quer de ChS, quer de amido/CRG, as quais foram administradas aos ratinhos por inalação, num total de dez aplicações num intervalo temporal de duas semanas. Após o sacrifício dos animais foi avaliado o índice tecidular de diferentes órgãos, nomeadamente fígado, pulmão e rim, e realizada a análise de esfregaços sanguíneos, de modo a verificar o tipo de leucócitos presentes. Não foram observadas alterações do índice tecidular de nenhum dos órgãos analisados, nem se registaram modificações das percentagens dos vários leucócitos constituintes do sangue, para nenhuma das formulações de micropartículas. Os níveis séricos de ALT, AST e LDH, marcadores de alterações tecidulares, também não demonstraram alterações significativas, o que indica a tolerância dos animais ao contacto com as micropartículas e os seus materiais constituintes. As formulações desenvolvidas ao longo deste trabalho demonstraram possuir características adequadas para a entrega de fármacos por via inalatória, com o propósito de alcançar a região alveolar e proporcionar um direcionamento para os macrófagos. No geral, a formulação com matriz de sulfato de condroitina (ChS/INH/RFB), produzida utilizando etanol como co-solvente, foi a que demonstrou melhores propriedades, sendo aquela identificada como tendo mais potencial.

Tuberculosis remains a leading cause of death, with therapeutic failure being mainly due to non-compliance with prolonged treatments, often associated with severe side-effects. New therapeutic strategies are demanded and, considering that the lung is the primary site of infection, direct lung delivery of antibiotics is an interesting and, possibly, effective approach. Therapeutic success in this context depends on suitable carriers that reach the alveoli where Mycobacterium hosts (macrophages) reside, as well as on their ability to promote macrophage capture and intracellular accumulation of drugs. In this work, we propose inhalable polymeric microparticles produced by spray-drying and tailored to suitable aerodynamic properties to reach the alveoli. Macrophage targeting will be driven by microparticle composition based on chondroitin sulphate or k-carrageenan. Both are sulphated polymers composed by moieties preferentially recognised by macrophage surface receptors. The spray-dried microparticles successfully associated two first-line antitubercular drugs (isoniazid and rifabutin). Furthermore, starch/CRG and ChS microparticles presented satisfactory aerodynamic properties, compatible with deep lung deposition. In ChS microparticles, ethanol and HCl were tested as co-solvents to aid the solubilisation of RFB and microparticles produced with ethanol general revealed the best features, being selected for further assessment. ChS-based formulations evidenced absence of toxicity in alveolar epithelial cells and macrophages (human and mouse). Starch/CRG formulation exhibited some toxicity, especially in mouse macrophages. The latter further elicited stronger production of interleukins from human macrophages, compared with the mild response to ChS microparticles, which reflects the ability to activate macrophages. ChS microparticles also evidenced better ability to undergo macrophage uptake and were, thus, further evaluated in a high content analysis (HCA) assay evaluating the response of mouse macrophages to exposure (lipid accumulation, nuclei area, etc.). The results revealed no subtoxic effects after 48 h exposure. Free RFB demonstrated some phospholipid accumulation, which was overpassed upon microencapsulation. Considering the general trend of the results, good indications are given that encourage the continuation of the studies in order to establish the potential of these microparticles as inhalable carriers in tuberculosis treatment.