Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas
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- An evo-devo approach to vertebral body development: going back to progenitorsPublication . Azevedo, Tomás Augusto Barreiros Pais de; Palmeirim, Isabel; Witten, Paul Eckhard; Andrade, Raquel P.The segmented signal for vertebral body development is conveyed, in zebrafish, through mineralization of the notochordal sheath and, in chicken, through resegmentation of the most medially located ventral sclerotome cells, with the contribution of the notochord still unclear. Along with the different size of the notochord in these two embryos, this leads to the hypothesis that evolutionary changes in the expression territories of transcription factors could underlie these differences. In the zebrafish axial(notochord)/paraxial(PSM/somite/sclerotome) mesoderm progenitor region, flh normally represses spt that normally defines paraxial mesoderm fate, leading to an axial mesoderm one instead. The aims of this thesis were to clarify the role of the notochord in chicken segmented vertebral body formation and investigate the role of transcription factor evolutionary changes in this process’s differences between zebrafish and chicken. In chapter II we thoroughly describe the first morphological landmark of segmented vertebrae, Von Ebner’s fissure, using it as a proxy to observe that the notochord and dermomyotome are not responsible for vertebral body segmented signal initiation. In chapter III, through CNOT2 electroporation experiments, we observe an increase in the axial mesoderm size (notochord and floor plate), accompanied by a shortening of axial length and downregulation of TBX6L. We conclude that CNOT2 represses TBX6L, leading axial/paraxial progenitor cells to assume an axial mesoderm cell fate. In chapter IV, we fill in a lingering chicken embryo knowledge gap, by producing a detailed quantification of early axis elongation. At the same time, we provide a reproducible and precise staging system and a morphometric tool to analyze experimental data. This thesis demonstrates the evolutionary shift in preponderance from the notochord to the PSM/somites/sclerotome in the role on segmented signal location and axial elongation. It also proposes that changes in the flh/CNOT2 and spt/TBX6L expression territories in the axial/paraxial mesoderm region are underlying these shifts.
- Assessing the importance of deltaC mRNA 3’utr for zebrafish somitogenesisPublication . Rodrigues, Leonardo Abraão da Silva; Andrade, Raquel P.; Carraco, GilSomitogenesis is a critical process in early vertebrate development, leading to the periodic formation of somites from the presomitic mesoderm (PSM) along the rostral-caudal axis during body elongation. These somites, which serve as embryonic precursors to the axial skeleton, are crucial for the proper development of vertebrae and other segmented structures. While the periodicity of somite formation can vary significantly between species, it remains highly constant within each species. This periodicity is driven by the embryo clock (EC), an intrinsic mechanism in PSM cells that relies on oscillations of gene expression, regulated through negative feedback loops, requiring short-lived mRNA transcripts. The stability of these transcripts is influenced by regulatory regions (RR) within the mRNA 3’ Untranslated Region (3’UTR). Proper somite formation requires synchronization between PSM cells, facilitated by Notch-Delta signaling, which coordinates cellular division and differentiation. This work investigated the role of the 3’UTR of the zebrafish deltaC clock gene in somite formation periodicity. Various zebrafish mutant lines were generated using CRISPR/Cas9. A previously generated mutant line (RR2) was characterized, assessing somite number, size, periodicity of formation, as well as the expression of EC genes. The comparison between the RR2 mutant and wildtype embryos showed no differences in somite size or number. Also, deltaC and her7 clock gene expression were unaltered. However, the RR2 mutant showed a slight decrease in the periodicity of somite formation. In conclusion, this work describes new animal model systems to study the embryo clock and provided new data on the importance of deltaC mRNA 3’UTR for somite formation.
- Elucidação do papel de brachyury na diferenciação de distintas linhagens celulares: implicações na tumorigénesePublication . Conceição, Ana Catarina Silva; Andrade, Raquel P.; Moura, RuteBrachyury é um fator de transcrição expresso muito cedo no desenvolvimento embrionário enquanto marcador dos precursores de mesendoderme. Este apresenta níveis elevados de expressão nos tecidos derivados da mesoderme, que diminuem e desaparecem à medida que as células se diferenciam em estruturas definitivas. De acordo com estes dados, verificou-se que em tumores de tecidos derivados da mesendoderme (como por exemplo, cancro da próstata e gastrointestinal), a presença de Brachyury está associada a um maior grau de indiferenciação celular, resultando em pior prognóstico, pior resposta terapêutica, maior recorrência e menor sobrevida. Inversamente, em tumores de tecidos derivados da neuroectoderme embrionária, tais como os gliomas, Brachyury comporta-se como um gene supressor tumoral, sendo um biomarcador independente de bom prognóstico e favorecendo a resposta terapêutica. O nosso grupo de investigação possui dados preliminares que demostram a expressão de Brachyury associada à diferenciação do sistema nervoso central. Para além desses, outros dados do nosso grupo indicam que a proteína Hairy1, pertencente ao relógio molecular embrionário, não só co-localiza com o marcador mesodermal Brachyury (T) durante a gastrulação, como também interage fisicamente com esta proteína. Neste trabalho, foi realizada uma caracterização da expressão de Brachyury e de Hairy1 no embrião de galinha em desenvolvimento, no tempo e no espaço por imunohistoquímica. Para além disso, a presença de Brachyury e Hairy1 na diferenciação da mesoderme e da neuroectoderme foi estudada através da deteção de isoformas ou de complexos proteicos diferentes por western blot. Os nossos resultados mostram que Brachyury e Hairy1 estão a ser expressos em tecidos neurais do embrião de galinha. A elucidação do papel de Brachyury na diferenciação de cada linhagem celular irá contribuir para uma melhor compreensão dos processos tumorigénicos em que está implicado.
- Importância da região 3´UTR do mRNA do deltaC no desenvolvimento de Peixe-ZebraPublication . Tavares, Alene Patrícia Semedo; Andrade, Raquel P.; Campinho, Marco A.A somitogénese é um processo morfogenético altamente regulado e conservado entre os vertebrados. Durante este processo ocorre a formação de sómitos de forma rítmica e sequencial ao longo do eixo ântero-posterior do embrião a partir de um tecido progenitor não segmentado denominado de mesoderme pré-somítica (PSM). Os sómitos são aglomerados de células da mesoderme, precursores do esqueleto e da musculatura axial. A periodicidade da formação de sómitos a partir da PSM é imposta por um oscilador molecular denominado de relógio molecular que leva à expressão cíclica de um conjunto de genes, que se propaga ao longo da PSM no sentido caudo-rostral. A comunicação celular e a sincronização das oscilações de expressão na PSM através da sinalização intercelular Notch-Delta são fundamentais no controlo da somitogénese e da diferenciação celular. Esta oscilação da expressão dos genes do relógio é controlada por um mecanismo de regulação de feedback negativo, onde a instabilidade do mRNA desempenha um papel fundamental. A região 3´UTR geralmente contém vários elementos reguladores que governam a expressão espacial e temporal de diferentes mRNAs. Estudos anteriores do laboratório demostraram uma estabilização do mRNA do gene deltaC de peixe-zebra na ausência de porções da região 3´UTR. Para melhor compreensão do fenótipo, neste trabalho foi avaliado o papel da região 3’UTR do gene deltaC na somitogénese de embriões de peixe-zebra. Para isso foram utilizadas diferentes linhas mutantes em que a região 3'UTR do gene deltaC foi editada usando a tecnologia CRISPR/Cas9. Procedeu-se à caracterização do padrão de expressão dos genes her7 e deltaC e caracterização morfológica dos sómitos formados para perceber o impacto destas alterações. Os resultados do presente estudo confirmaram que a região 3´UTR de deltaC é importante para a correta expressão de deltaC e her7, bem como para a segmentação corporal do embrião de peixe-zebra. Embora nos embriões RR2 e RR3 a segmentação não é interrompida, o número total de sómitos é menor e os sómitos anteriores são ligeiramente mais curtos. Usando uma linha transgénica em que o Notch Intracellular Domain (NICD) é expresso constitutivamente após indução térmica observou-se diminuição do tamanho dos sómitos como nos embriões RR3 o que sugere que o fenótipo observado nos embriões mutantes poderá ser devido a um aumento da sinalização Notch durante a somitogénese.
- Regulating the pace of the embyo clock: RNA molecules in temporal control of vertebrate developmentPublication . Carraco, Gil Daniel Bregieiro; Andrade, Raquel P.Durante as últimas décadas têm-se estudado com profundidade os mecanismos genéticos que levam ao correto desenvolvimento do embrião vertebrado. Estes mecanismos têm sido estudados especialmente na caraterização da expressão genética nos tecidos e de que modo a sua presença ou ausência se reflete na correta diferenciação de uma célula, no desenvolvimento de um tecido ou órgão e na correta formação do organismo. Contudo para além da localização e intensidade da expressão, uma outra dimensão muito menos explorada é o Tempo. A desregulação temporal da expressão génica pode levar a que os tecidos se diferenciem num momento ou ritmo impróprio, podendo ter consequências graves e levar mesmo à morte do organismo. Um dos processos que evidencia uma periodicidade durante o desenvolvimento, é a somitogénese. À medida que o embrião alonga ao longo do eixo antero-posterior graças à ingressão de células no botão caudal, as células da mesoderme pré-somítica (PSM) anterior formam periodicamente pares de estruturas esféricas transitórias que flanqueiam a notocorda, conhecidas como sómitos. Os sómitos diferenciam-se sendo responsáveis pela formação do esqueleto axial, bem como da musculatura esquelética e a derme das costas. A desregulação temporal da somitogénese, provoca doenças congénitas graves que afetam especialmente a formação das vertebras, como a disostose espondilocostal. Existe um relógio embrionário (EC) subjacente à periodicidade da somitogénese. O EC foi primeiramente descrito por Palmeirim e colegas (1997) no desenvolvimento do embrião de galinha. Este grupo descobriu que o gene hairy1 tem ciclos de expressão na PSM com o mesmo período que a somitogénese, 90 minutos. Posteriormente, este mecanismo foi descoberto noutros organismos e hoje em dia, sabe-se que é conservado em todos os vertebrados. O período EC é específico de cada espécie, sendo, por exemplo, 30 minutos no peixe-zebra, 120 no ratinho e entre 5 e 6 horas no Humano. Sabe-se também que vários genes pertencentes a várias vias de sinalização possuem expressão cíclica. Mais concretamente, pertencentes às vias de Notch, FGF e WNT. Dez anos depois da descoberta do EC, foi descrito que este mecanismo não era exclusivo da PSM. Pascoal e colegas (2007) descobriram que o relógio embrionário estava presente no crescimento do membro da galinha. Mais concretamente, o grupo descreveu que o gene hairy2 tem uma expressão cíclica, apresentando um período de seis horas em vez dos 90 minutos na PSM. O EC é caracterizado por mecanismos de regulação por feedback negativo em que um gene é expresso e traduzido e a proteína vai reprimir a sua própria expressão. Para além disso, o mecanismo é refinado por atrasos em diversas etapas, desde a transcrição, passando pela exportação nuclear do mRNA, pela tradução e terminando na degradação do mRNA e da proteína. Contudo, a regulação do EC, mais propriamente, como é capaz de apresentar diferentes períodos no mesmo organismo, ainda permanece por esclarecer, constituindo a questão central do presente trabalho. Neste trabalho foi explorada a hipótese da regulação da periodicidade do EC em diferentes tecidos ser exercida ao nível das moléculas de RNA. Para abordar esta hipótese, foram aplicadas diversas metodologias experimentais. Em primeiro lugar foram identificados os transcritos produzidos por hairy1 e analisado o seu impacto na segmentação do tronco embrionário (Capítulo 2). Para tal, foi feita uma sobre-expressão de ambos os transcritos identificados na PSM do embrião de galinha. Os nossos resultados indicam que a sobreexpressão do s-hairy1, tal como de hairy1, leva a um atraso no alongamento dos embriões, e a um atraso no início da somitogénese. Neste capítulo, adicionalmente, procurámos aprofundar o conhecimento acerca do relógio embrionário no membro. Estudámos a expressão de hairy1, descobrindo que também cicla com um período de 6 horas no mesênquima distal do membro. A região 3’UTR do mRNA é um dos maiores responsáveis pela regulação do tempo de meia-vida do próprio mRNA. Tendo isso em mente, estudámos os 3’UTRs de três genes centrais do relógio embrionário do peixe-zebra, her1, her7 e deltaC (dlc) (Capítulo 3). No caso de her1 e her7 deletou-se 3’UTR alternativos, contudo os resultados obtidos não revelaram um papel para os 3’UTRs alternativos no funcionamento do EC. No caso do gene dlc, dividiuse o 3’UTR em três regiões de regulação (RR), e procedeu-se à deleção dessas regiões isoladamente, ou em combinação. Quando deletadas RR1, RR2 ou a combinação das duas (RR1&2), não foram detetadas alterações significativas à expressão de dlc. Contudo, quando foram removidas RR3 ou RR2&3 obteve-se uma estabilização da expressão dos genes do EC. Uma avaliação mais aprofundada das deleções RR2 e RR3 revelou que os embriões produziam menos sómitos e mais pequenos, resultado mais notório na deleção RR3. Em ambos os casos também se verificou uma estabilização da expressão de her7. Por último, decidiu-se estudar se os miRNAs podem estar envolvidos na regulação dos períodos do EC (Capítulo 4). Para tal, analisou-se o miRNoma por sequenciação de RNA a partir de três tecidos que apresentam oscilações do EC com diferentes ritmos: PSM determinada (D-PSM), PSM indeterminada (U-PSM) e o domínio distal cíclico do membro superior (DCD). Foram identificados 926 miRNAs conhecidos. Para além disso descobrimos mais 1141 possíveis novos miRNAs em galinha (quase duplicando os que se encontram anotados na base de dados miRBase). Procedemos, posteriormente, a uma análise de expressão diferencial e à validação dos dados por RT-qPCR. Adicionalmente, os miRNAs diferencialmente expressos entre os tecidos foram comparados com os genes negativamente regulados nos mesmos tecidos e procedemos a uma análise de enriquecimento funcional GO e REACTOME. Em suma, utilizando uma nossa estratégia plural para testar a nossa hipótese, levounos a um aprofundar do conhecimentos dos mecanismos que controlam a expressão genética periódica nos tecidos onde o EC opera.
- The impact of the embryonic molecular clock in early chick embryo elongationPublication . Fernandes, Ana Cristina Maia; Andrade, Raquel P.; Palmeirim, IsabelEmbryo development is strictly regulated in time and space. One of the mechanisms by which cells have temporal information is the somitogenesis clock. During somitogenesis, somites are formed periodically from the pre-somitic mesoderm (PSM) along the antero-posterior axis. The periodicity of somitogenesis is regulated by an oscillatory gene network that operates within PSM with the same period as somite formation. A member of this network in chick is hairy1, a member of the Hairy and Enhancer of Split (HES) family of transcription factors. The role of Hes proteins in biological contexts is broad, namely in development and more recently in cancer. Previous work from our lab showed that Hairy1 overexpression in PSM precursors in gastrulation stages delays embryo development. To understand this phenotype, we started by evaluating the expression pattern of hairy1 mRNA in gastrulating embryos. hairy is dynamically expressed along the antero-posterior and medial-lateral axes of the primitive streak. To evaluate embryo elongation, we performed live-imaging of embryos cultured in two different techniques: Chapman and New. The embryo elongates continuously over time with an average rate of 159 ± 55 uum/h independently of the culture system. The PSM and segmented region contribute the most for total embryo elongation. To understand the impact of Hairy1 overexpression we electroporated the PSM precursors in gastrulation stages and evaluated embryo elongation over time. The preliminary data obtained suggests that Hairy1 overexpression delays embryo elongation. Our work provides a novel quantitative framework for embryo elongation which can be used for comparative studies of chick embryo development in different conditions. Also, it gives new insights on the role of Hairy1 during embryo development which could be important to better understand development and diseases, such as Cancer.