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Browsing FCB1-Teses by Author "Afonso, Inês Torquato"
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- Biodistribution analysis of striatal and cerebellar administration of modified adeno-associated viral vectors in normal micePublication . Afonso, Inês Torquato; Nobre, Rui Jorge; Nóbrega, ClévioOs vírus adeno-associados (AAV) têm 25 nm de diâmetro e transportam uma molécula de DNA de cadeia simples. O seu genoma está flanqueado por duas repetições terminais invertidas e codifica para proteínas de replicação, proteínas da cápside e para a proteína AAP. É um vírus cuja replicação depende da co-infeção com outro vírus, como por exemplo o adenovírus ou o herpes simplex vírus, pois não possui a capacidade de se replicar por si só. Até hoje foram descritos 13 serótipos de AAV e não existe na literatura doenças associadas à sua infeção. Os vetores AAV demonstraram ser sistemas de entrega seguros e fiáveis para entrega de transgenes terapêuticos no sistema nervoso central, mas também noutros órgãos e tecidos. O sistema nervoso central possui um caráter imuno privilegiado, uma vez que, está protegido pelas meninges, pela barreira hemato-encefálica e pelo líquido cefalorraquidiano, que em conjunto previnem a passagem de agentes nocivos exógenos, mas também de agentes terapêuticos. É, portanto, urgente encontrar novos métodos para que o transgene terapêutico atinja as células alvo no tratamento ou na cura de doenças neurológicas. O presente estudo pretende investigar as propriedades do novo vetor mosaico AAV1/AAV2 injetado no estriado e nos núcleos profundos do cerebelo (DCN), comparando-o com os serótipos parentais AAV1 e AAV2. Os critérios avaliados foram a biodistribuição do vetor pelo cérebro, as regiões do cérebro que é capaz de transduzir, o tipo de células que infeta e a toxicidade inerente à sua administração. O novo vetor mosaico AAV1/AAV2 é um AAV recombinante que transporta uma cadeia de DNA simples constituído por as repetições terminais repetidas do serótipo AAV2, o gene que codifica para a proteína green flourescent protein (GFP) e pelo promotor do citomegalovírus. A particularidade que diferencia este vetor dos já existentes, é a constituição da sua cápside, uma vez que a mesma é constituída por proteínas da cápside do serótipo AAV1 e do serótipo AAV2, originando-se por isso uma cápside tipo mosaico, daí o nome, vetor mosaico AAV1/AAV2. Ao possuir estes dois serótipos como constituintes da sua cápside, é possível que o vetor mosaico contenha características das cápside dos vetores parentais tais como, a capacidade de transduzir as células neuronais, característica dos AAV1 e ao mesmo tempo seja capaz de reconhecer o recetor de heparina que é comumente conhecido por ser o recetor primário do AAV2. Este recetor é por isso utilizado para o processo de purificação dos vetores recombinantes do AAV2, através de cromatografia por afinidade à heparina. Desta forma, há a possibilidade do vetor mosaico AAV1/AAV2 poder ser purificado pelo mesmo método. O método da tripla transfecção foi utilizado para a produção dos vetores virais. Este consiste na transfecção de uma linha celular de packaging (HEK293) com três plasmídeos: um plasmídeo helper, um plasmídeo com o transgene de interesse e um plasmídeo que codifica para as proteínas da cápside; que, neste caso específico, são dois plasmídeos, um codificante para as proteínas da cápside do serótipo do AAV1 e outro codificante para as proteínas da cápside do serótipo AAV2. Do mesmo, resulta a produção de um novo vetor com aproximadamente 50% de proteínas da cápside do serótipo AAV1 e os restantes 50% do serótipo AAV2. Numa primeira experiência, murganhos C57BL/6 foram injetados no estriado com 3×109 genomas virais (vg) do vetor mosaico AAV1/AAV2 ou com um dos vetores dos serótipos parentais, AAV1 ou AAV2. Numa segunda experiência, os murganhos foram injetados nos núcleos profundos do cerebelo com 5×109 vg do vetor mosaico AAV1/AAV2 ou com os vetores dos serótipos parentais. Um mês após a injeção, os animais foram sacrificados e o cérebro foi separado, um hemisfério para análise molecular e outro dos hemisférios para análise histológica. Os resultados sugerem que o vetor mosaico AAV1/AAV2 tem uma melhor biodistribuição e transdução comparativamente aos vetores dos serótipos parentais, aquando da sua injeção no estriado. No estriado, os vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2 foram capazes de se espalhar desde a região da injeção para a região mais dorsal do cérebro. No cerebelo os vetores distribuíram-se desde os núcleos profundos do cerebelo para todo o cerebelo, assim como para as regiões que o cerebelo recebe e envia projeções. No estriado, o vetor mosaico AAV1/AAV2 foi o que obteve melhores resultados de transdução e biodistribuição, sendo capaz de transduzir o córtex, o estriado, tálamo, os núcleos endopiriformes, núcleos sub-talâmicos e o globus pallidus; enquanto que, aquando a injecção nos núcleos profundos do cerebelo, o vetor do serótipo AAV1 teve melhor transdução e biodistribuição, sendo capaz de transduzir o cerebelo, o tálamo, o mesencéfalo, o núcleo central da amígdala, a medula e a ponte. Tanto no estriado, como nos núcleos produndos do cerebelo não foi possível inferir o tropismo celular dos vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2, pois nenhum co-localizou com os marcadores utilizados, NeuN, GFAP e Iba-1 que marcam respetivamente, os neurónios, astrócitos e microglia. No entanto, é possível verificar a transdução das células de Purkinje por microscopia, uma vez que, a região onde estas se localizam se encontra a expressar GFP. Os testes toxicológicos revelaram que após a administração dos vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2 no estriado, não houve perda de marcador neuronal. Em conclusão, o vetor mosaico AAV1/AAV2 demonstrou ser um vetor seguro, com resultados que indiciam ser um bom candidato para transdução de células do sistema nervoso central. Este foi capaz de manter o tropismo celular do serótipo parental AAV1 e, simultaneamente, ser purificado pelo método de purificação utilizado para o AAV2, i.e. a cromatografia de afinidade à heparina. Aquando da injeção do vetor mosaico AAV1/AAV2 no cerebelo, a biodistribuição parece estar diminuída em relação ao serótipo AAV1, o que levanta a questão quanto ao contributo do serótipo AAV2 para o modo de dispersão do vetor nesta região. No futuro são necessários testes complementares para determinar se a utilização do vetor mosaico AAV1/AAV2 é superior relativamente aos serótipos parentais e ainda determinar a população neuronal especifica traduzida pelo vetor de interesse. Seria muito interessante que o vetor AAV1/AAV2 fosse empacotado com um gene terapêutico para ser testado, por exemplo, num modelo animal de uma doença neurodegenerativa. Caso os resultados demonstrassem que a utilização do vetor mosaico AAV1/AAV2 fossem vantajosos em relação aos vetores conhecidos, poderia vir a ser utilizado em ensaios clínicos para o tratamento ou cura de doenças neurodegenerativas.