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- Impact of dietary protein hydrolysates on skeleton quality and proteome in Diplodus sargus larvaePublication . Vareilles, Mahaut; Richard, Nadège; Gavaia, Paulo J.; Silva, Tomé S.; Cordeiro, O.; Guerreiro, Inês; Yúfera, M.; Batista, I.; Pires, C.; Pousão-Ferreira, P.; Rodrigues, Pedro; Rønnestad, I.; Fladmark, K. E.; Conceição, L. E. C.In order to investigate the effects of dietary protein hydrolysates (PH) on larval growth performance, skeleton quality and proteome expression, triplicate groups of white seabream (Diplodus sargus) larvae were co-fed from first-feeding with live feed and three microencapsulated diets differing in the molecular weight of their PH fraction (Control – inclusion of CPSP-90; H – inclusion of a high amount in 0.5–30 kDa hydrolysates; L – inclusion of a high amount in <0.5 kDa hydrolysates). At 15 days after hatching (DAH), proteome expression changes were assessed in entire larvae by twodimensional gel electrophoresis and the quality of larval skeleton was analysed at 28 DAH through double staining of cartilage and bone. Dietary PH fractions tested affected growth, the larvae fed diet L being significantly larger than those fed diet H, but it did not affect the incidence of deformed larvae, nor the number of deformities per fish. Two-dimensional analysis of larvae proteome allowed the detection and the comparative quantification of a total of 709 protein spots having a pI between 4 and 7, around half of which had an expression significantly affected by dietary treatment, the main difference being between proteome of Control larvae with those of both groups L and H. From these spots, 52 proteins involved in diverse processes such as cytoskeletal dynamics, energetic, lipoprotein, amino acid (AA), and nucleotide metabolisms, protein chaperoning and degradation, and signal transduction, were identified. This study revealed that the molecular weight of the dietary protein hydrolysate fraction had a minor impact on skeletal deformities in white seabream larvae, but affected growth performance and had a strong impact on larvae whole body proteome.
- The influence of inert diets on digestive capacity of fish larvae species: Diplodus sargus and Solea senegalensisPublication . Guerreiro, Inês; Ribeiro, L.; Ferreira, Pedro PousãoO conhecimento da fisiologia digestiva de larvas de peixes marinhos ao longo do seu desenvolvimento é crucial para compreender as capacidades digestivas das espécies, e assim permitir a sua produção em aquacultura. O sargo, Diplodus sargus, e o linguado, Solea senegalensis, são duas espécies de elevado valor económico e com potencial de cultivo, sendo por isso importante estudar aspectos relacionados com a sua fisiologia digestiva. Com este trabalho pretendeu-se estudar a influência do alimento inerte na capacidade digestiva do sargo e do linguado, através da quantificação da actividade de diferentes enzimas digestivos. No caso do sargo, analisou-se o efeito de uma adaptação precoce ao alimento inerte, ao introduzir-se a dieta aos 20 dias após a eclosão (DAE; W20) e comparando com o tratamento em que a dieta foi introduzida aos 27 DAE (W27; normal/controlo). No caso do linguado avaliou-se a estratégia de adaptação ao alimento inerte, nomeadamente uma adaptação súbita – tratamento SW – ou uma co-alimentação durante 5 dias – tratamento CF –, ambos com início aos 30 DAH. No caso do sargo consideram-se duas fases experimentais. Na primeira fase que decorreu até aos 20 dias, analisou-se o padrão da actividade enzimática ao longo do desenvolvimento das larvas. Na segunda fase, avaliou-se o efeito de uma adaptação precoce ao alimento inerte nos enzimas digestivos durante 3 semanas, terminando o ensaio aos 41 e 48 DAE, respectivamente, para o tratamento W20 e W27. O plano alimentar consistiu em rotíferos (4-26 DAE), Artemia naupli (13-19 DAE), Artemia metanaupli (16-26 DAE para o tratamento W20 e 16-33 DAE para o tratamento W27) e alimento inerte (20-41 DAE para o tratamento W20 e 27-48 para o tratamento W27). Em relação ao linguado, o período experimental decorreu entre os 30 e 60 DAE consistindo o plano alimentar em Artemia (30-34 DAE para o tratamento CF) e alimento inerte (30-60 DAE). No caso do sargo, realizaram-se amostragens aos 0, 2, 9, 13 e 20 DAE para caracterizar o padrão de actividade digestiva. Enquanto no ensaio de adaptação ao alimento inerte, realizaram-se amostragens no início da adaptação, uma e três semanas após a introdução do alimento inerte. Em relação ao linguado, efectuaram-se amostragens aos 30, 35, 40, 50 e 60 DAE pós-larvas de linguado. No sargo analisou-se a tripsina, a amilase, a pepsina, a lipase, a fosfatase alcalina, a leucina-alanina peptidase, a aminopeptidase e a fosfatase ácida. No linguado apenas foi analisado a tripsina, amilase, pepsina, fosfatase alcalina, aminopeptidase e leucina-alanina peptidase. Os dados da actividade enzimática foram apresentados como actividade específica: U mg protein−1 e actividade total: U larva−1. iv A actividade enzimática foi determinada em diferentes segmentos, ao longo do desenvolvimento larvar. No sargo, até aos 20 DAE utilizou-se todo o corpo da larva para a análise enzimática, enquanto as larvas mais velhas foram dissecadas a fim de se obter a porção abdominal. No linguado, até aos 40 DAE as pós-larvas foram dissecadas obtendo-se a porção abdominal, enquanto nas idades posteriores as póslarvas foram dissecadas para se obter o segmento pancreático e o intestinal, o qual foi ainda utilizado para obter o prato estriado do intestino. As larvas de sargo apresentaram um crescimento exponencial tanto em peso como em comprimento. Até aos 20 DAE as actividades específicas da tripsina, fosfatase alcalina, leucina-alanina peptidase, aminopeptidase e fosfatase ácida aumentaram significativamente, enquanto as actividades específicas da pepsina, amilase e lipase mantiveram-se relativamente constantes. As actividades da lipase e leucina-alanina só foram detectadas aos 9 DAE. A actividade da pepsina teve o maior valor de actividades aos 0 DAE mas aos 2 DAE não se detectou actividade. A actividade total dos enzimas estudados aumentou significativamente até aos 20 DAE. No ensaio de adaptação ao alimento inerte, as larvas de sargo do tratamento W27 comparativamente às larvas do tratamento W20 apresentaram um maior crescimento em peso e comprimento e uma sobrevivência superior. Três semanas após a introdução do alimento inerte no plano alimentar do sargo, as larvas do tratamento W20 apresentavam uma tendência em ter uma actividade enzimática superior, embora sem apresentarem diferenças significativas entre os tratamentos. Neste mesmo período, as larvas do tratamento W20 comparativamente com as larvas do tratamento W27 apresentaram no prato estriado uma maior actividade específica da aminopeptidase. A actividade total dos enzimas estudados aumentou significativamente até ao final da experiência, sendo significativamente maior nas larvas do tratamento W27. No entanto, analisando o aumento relativo da actividade dos enzimas digestivos, observou-se que as larvas do tratamento W20 exibiram um aumento relativo após as três semanas da introdução do alimento inerte no plano alimentar. Três semanas após a introdução do alimento inerte não se observaram diferenças significativas no índice de maturação dos enterócitos para ambos os tratamentos. Em relação ao linguado, as pós-larvas do tratamento SW comparativamente às pós-larvas do tratamento CF apresentaram um maior crescimento em peso e comprimento e uma sobrevivência superior. As actividades específicas da tripsina, fosfatase alcalina e leucina-alanina peptidase decresceram até aos 40 DAE, enquanto as actividades específicas da amilase, pepsina e aminopeptidase se mantiveram relativamente constantes até os 40 DAE. A esta idade não existiram diferenças v significativas entre as actividades específicas dos tratamentos. As actividades específicas determinadas no prato estriado decresceram até aos 40 DAE, mas sem se observarem diferenças significativas entre os tratamentos. A actividade total até aos 40 DAE teve uma tendência decrescente mas sem diferenças estatísticas entre os tratamentos. Considerando a fosfatase alcalina, aos 40 DAE a percentagem de maturação dos enterócitos é significativamente superior nas larvas do tratamento SW. Aos 60 DAE não ocorreram diferenças significativas nas actividades específicas dos enzimas entre os tratamentos do linguado. Os valores de actividade total analisados no pâncreas e intestino mantiveram-se quase inalterados entre as duas idades e tratamentos analisados. Aos 60 DAH não ocorreram diferenças significativas entre tratamentos relativamente à percentagem de maturação dos enterócitos. O padrão de actividade dos enzimas digestivos estudados no sargo esteve relacionado com a organogénese e o tipo de alimento usado nos diferentes estados de desenvolvimento. Este estudo permitiu verificar que antecipando a introdução do alimento inerte no plano alimentar das larvas de sargo, neste caso aos 20 DAE, a capacidade digestiva não é afectada, uma vez que as larvas no final do período experimental apresentavam níveis de actividade enzimática semelhantes aos apresentados pelas larvas do tratamento W27. A actividade enzimática no linguado não foi afectada pelo tipo de desmame e, quando o foi, no final do período experimental o nível de actividade enzimática era semelhante para ambos os tipos de desmame. O método de desmame mais ambicionado pela indústria é o desmame súbito já que permite uma redução na utilização de alimento vivo. Neste estudo o tipo de desmame que menos afectou fisicamente as pós-larvas foi o desmame súbito, mas os resultados não permitem concluir que este seja o melhor método, já que ambas as estratégias alimentares produziram fracos resultados. O decréscimo observado na actividade enzimática total reflectiu a baixa condição física exibida pelas pós-larvas de ambos os tratamentos.