Cadmium and vanadium compounds interactions with sarcoplasmic reticulum calcium pump

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Contribuição de decavanadato para os efeitos IN VIVO e IN VITRO de vanadato no músculo cardíaco

Publication . S. Soares, Sandra; Coucelo, Josefina; Aureliano, M.; Gutiérrez-Merino, Carlos

No presente estudo aborda-se a contribuição da espécie decamérica de vanadato nos efeitos tóxicos in vivo e in vitro de vanadato. Após administração intravenosa de decavanadato em Sparus aurata, o vanadato decamérico induz respostas nos marcadores de stresse oxidativo do tecido cardíaco distintas das promovidas pelo monovanadato, evidenciando a importância de considerar a contribuição dos diferentes oligómeros de vanadato para a toxicidade in vivo de vanadato. Quando administrado na forma de vanadato decamérico, a acumulação de vanádio na mitocôndria sugere este organelo como potencial alvo da toxicidade de vanadato. Estudos in vitro demonstraram que o vanadato decamérico é um potente agente despolarizador da membrana mitocondrial e inibidor do consumo de oxigénio, para além de impedir a repolarização da membrana mitocondrial, em mitocôndrias de coração de peixe e fígado de rato. Verificou-se também que o vanadato decamérico afecta a bioenergética mitocondrial bloqueando a cadeia transportadora de electrões da mitocôndria. Em cardiomiócitos, descreve-se a despolarização da membrana mitocondrial como um evento precursor de morte celular necrótica induzida por vanadato. Conclui-se que, o vanadato decamérico induz efeitos diferentes dos promovidos do monovanadato nos sistemas biológicos, através de diferentes mecanismos, contribuindo, pelo menos em parte, para os efeitos tóxicos induzidos por vanadato na mitocôndria.

2007Doctoral thesis

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Susceptibilidade do subfragmento-1 de miosina de músculo esquelético de coelho ao peroxinitrito

Publication . Simão, Sónia; Aureliano, M.

Foi já demonstrado que, em disfunções cardíacas, o compartimento miofibrilar é um local de formação de peroxinitrito (ONOO-) e consequente nitrosilação das proteínas miofibrilares. Existe muito pouca informação, in vitro, acerca dos mecanismos pelos quais as proteínas miofibrilares são afectadas por esta espécie. Por este motivo, neste trabalho determinou-se a susceptibilidade do subfragmento-1 (S1) de miosina de músculo esquelético de coelho a uma exposição aguda e crónica, in vitro, à espécie ONOO-, produzida sinteticamente ou por decomposição de SIN-1, um composto que liberta simultaneamente as espécies .O e NO., que ao reagirem entre si formam o ONOO-. Os efeitos no S1 foram determinados medindo a actividade Mg2+-ATPase estimulada por F-actina, as actividades não-fisiológicas, Ca2+- e K+/EDTA-ATPase bem como a oxidação de cisteínas e nitrosilação de tirosinas. Testou-se ainda o ascorbato, GSH e NADH na protecção contra o ONOO-. Observou-se que a exposição crónica é mais eficiente que a exposição aguda e origina uma inibição da Mg2+-ATPase estimulada por F-actina na ordem dos 50% com 31,0  5,0 M SIN-1 para 8,7 M de S1. A Ca2+- e K+/EDTA-ATPase foram também inibidas com valores de IC50 semelhantes indicando que a oxidação dos grupos –SH reactivos de S1 contribui para o mecanismo de inibição da proteína. A nitrosilação de S1 ocorre no domínio de 25 kDa embora seja improvável que contribua para o mecanismo de inibição, uma vez que há menos de 0,1 resíduos de tirosina nitrosilados por mol de S1 para concentrações de SIN-1 que inibem 70% da actividade fisiológica da proteína. Os antioxidantes foram eficientes elevando a actividade da Mg2+-ATPase estimulada por F-actina em 70-100%. Os estudos permitiram concluir que o S1 de miosina de músculo esquelético de coelho é sensível a concentrações fisiologicamente relevantes de ONOO-, mas os efeitos desta espécie apenas se manifestarão em condições pato-fisiológicas nas quais exista deficiência de antioxidantes intracelulares.

2004Bachelor thesis

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Inhibition of skeletal muscle S1-myosin ATPase by peroxynitrite

Publication . Tiago, Teresa; S, Simão; Aureliano, M.; Martín-Romero, Francisco Javier; Gutiérrez-Merino, Carlos

Exposure of myosin subfragment 1 (S1) to 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) produced a time-dependent inhibition of the F-actin-stimulated S1 Mg2+-ATPase activity, reaching 50% inhibition with 46.7 ( 8.3 íM SIN-1 for 8.7 íM S1, that is, at a SIN-1/S1 molar ratio of approximately 5.5. The inhibition was due to the peroxynitrite produced by SIN-1 decomposition because (1) decomposed SIN-1 was found to have no effect on S1 ATPase activity, (2) addition of SIN-1 in the presence of superoxide dismutase and catalase fully prevented inhibition by SIN-1, and (3) micromolar pulses of chemically synthesized peroxynitrite produced inhibition of F-actin-stimulated S1 Mg2+-ATPase activity. In parallel, SIN-1 produced the inhibition of the nonphysiological Ca2+-dependent and K+/EDTA-dependent S1 ATPase activity of S1 and, therefore, suggested that the inhibition of F-actin-stimulated S1 Mg2+-ATPase activity is produced by the oxidation of highly reactive cysteines of S1 (Cys707 and Cys697), located close to the catalytic center. This point was further confirmed by the titration of S1 cysteines with 5,5¢-dithiobis(2- nitrobenzoic acid) and by the parallel decrease of Cys707 labeling by 5-(iodoacetamido)fluorescein, and it was reinforced by the fact that other common protein modifications produced by peroxynitrite, for example, protein carbonyl and nitrotyrosine formation, were barely detected at the concentrations of SIN-1 that produced more than 50% inhibition of the F-actin-stimulated S1 Mg2+-ATPase activity. Differential scanning calorimetry of S1 (untreated and treated with different SIN-1 concentrations) pointed out that SIN-1, at concentrations that generate micromolar peroxynitrite fluxes, impaired the ability of ADPâV1 to induce the intermediate catalytic transition state and also produced the partial unfolding of S1 that leads to an enhanced susceptibility of S1 to trypsin digestion, which can be fully protected by 2 mM GSH.

2006Journal article

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