Heterotrophic microbial communities growing in marine plastic leachates: characterization using CARD-FISH and BONCAT techniques

Amorim, Stéphanie Birnstiel Falcão

http://hdl.handle.net/10400.1/16693

Use this identifier to reference this record.

Name:	Description:	Size:	Format:
Thesis_Stephanie_Birnstiel_Final.pdf		847.97 KB	Adobe PDF	Download

Send Feedback

Authors

Amorim, Stéphanie Birnstiel Falcão

Advisor(s)

Nicastro, Katy

Castillo, Cristina Romera

Abstract(s)

Mais de 5 trilhões de peças de plástico estão presentes no oceano. Seus efeitos sobre os macroorganismos estão bem documentados e sabe-se que podem afetá-los principalmente devido à sua ingestão ou emaranhamento. No entanto, os estudos sobre seus efeitos em microrganismos são menos populares e focados, principalmente, na comunidade de biofilme que pode colonizar a superfície do plástico. Foi demonstrado que os plásticos marinhos são recobertos por matéria orgânica e inorgânica, seguida da colonização bacteriana, que é dominada por Gammaproteobacteria e Alphaproteobacteria, com a possibilidade de a bactéria Bacteroidetes aparecer mais tarde e se tornar abundante. Além disso, os plásticos geralmente contêm aditivos que são adicionados pela indústria para melhorar sua qualidade e desempenho. Esses aditivos e compostos, assim como os blocos monoméricos do plástico, podem ser liberados no meio aquático com consequências para a comunidade microbiana. Verificou-se que as bactérias marinhas absorvem os compostos orgânicos liberados pelo plástico, estimulando seu crescimento. No entanto, quais grupos de bactérias são capazes de usá-los e como isso os afeta ainda é desconhecido. Nossa hipótese é que os lixiviados plásticos podem alterar e afetar a composição e atividade da comunidade de bactérias heterotróficas marinhas quando expostas a diferentes condições ambientais e tipos de plástico. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a comunidade bacteriana e avaliar sua atividade após a exposição aos compostos liberados por diferentes tipos de plásticos. O estudo testou lixiviados de diferentes tipos de plástico comumente encontrados no oceano, como polietileno de baixa densidade (PEBD) e poliestireno (PS), sob uma variedade de condições ambientais, como diferentes temperaturas (15 e 28 °C), exposição à radiação UV e ambiente escuro. Um plástico biodegradável, ácido polilático (PLA), também foi usado para comparar com os lixiviados termoplásticos. Na etapa de fotodegradação, peças plásticas foram adicionadas à água do mar artificial (AMA) em tubos de quartzo, para tratamentos de luz, e em frascos de borosilicato revestidos com folha de alumínio, para tratamentos de escuro. Um experimento comparou PEBD e PLA a 15 °C, enquanto o outro comparou PEBD e PS a 28 °C. As amostras foram incubadas durante 6 dias sob radiação ultravioleta e luz visível e temperatura constante. Na etapa de biodegradação, lixiviados plásticos obtidos no experimento de fotodegradação anterior foram utilizados após a remoção das peças de plástico. Os lixiviados foram inoculados com um inóculo bacteriano natural do Observatório Microbial de Blanes Bay (NO Mediterrâneo). Sua curva de crescimento foi acompanhada até atingirem a fase estacionária. Em seguida, 72 horas após a inoculação, a comunidade bacteriana que foi capaz de crescer nesses lixiviados plásticos foi caracterizada pelo uso das técnicas de hibridização in situ fluorescente de deposição de repórter catalisado (CARD-FISH) e marcação de aminoácidos não canônicos bioortogonal (BONCAT). CARD-FISH é um método que usa sondas oligonucleotídicas marcadas com peroxidase de rábano (HRP) e amplificação do sinal de tiramida, a fim de detectar células com baixo conteúdo ribossômico, que são frequentemente prevalentes em águas oligotróficas. O BONCAT é um método que tem sido usado para caracterizar a atividade de micróbios não cultivados, em seu ambiente de crescimento nativo. Esta abordagem semiquantitativa explora o estado fisiológico das bactérias marinhas, incubando uma amostra bacteriana com um análogo da metionina e usando a química do clique para identificar as células que incorporaram o substrato. Sondas diferentes foram usadas para avaliar a composição da comunidade, como GAM42a, que tem como alvo a maioria das Gammaproteobacterias, CF319a, que tem como alvo muitos membros do grupo Bacteroidetes, EUB338 I-II e –III, que tem como alvo a maioria das bactérias, e Alf968, que tem como alvo as Alphaproteobacterias. Suas abundâncias foram calculadas em relação às suas contribuições para a comunidade total, enquanto sua atividade foi avaliada pelo cálculo de seu valor médio cinza (VMC), que é a soma dos valores de cinza de todos os pixels na célula dividida pelo número de pixels. Um teste-t de Student bicaudal foi aplicado a fim de comparar a abundância e a atividade dos diferentes grupos filogenéticos bacterianos. Em ambas as temperaturas, as bactérias começaram a crescer após 24 horas e atingiram a fase exponencial após 72 horas de incubação. Ao final de ambos os experimentos, as amostras de plástico apresentaram maior abundância bacteriana do que os controles sem plástico, exceto para o PS irradiado. Todos os tipos de lixiviados plásticos levaram a uma composição de comunidade microbiana semelhante: elas eram compostas principalmente por Gamma-, Alphaproteobacteria e Bacteroidetes. Ambos os experimentos apresentaram contribuições semelhantes de cada grupo filogenético para a abundância total. Gamma- e Alphaproteobacteria mostraram ser os maiores contribuintes, enquanto Bacteroidetes foi o grupo menos abundante. Os lixiviados plásticos estimularam o crescimento de Gamma- e Alphaproteobacteria nos tratamentos plásticos em relação aos controles sem plásticos. No entanto, o impacto sobre os Bacteroidetes foi mais variável. A irradiação durante a lixiviação de plástico teve resultados contrastantes na abundância bacteriana que dependeu do tipo de plástico e do grupo filogenético. No entanto, lixiviados plásticos previamente irradiados, como os encontrados no oceano, estimularam a síntese de proteínas em bactérias marinhas em relação àquelas não expostas anteriormente à radiação. Portanto, algumas exceções foram capazes de mostrar como diferentes condições e tipos de plásticos podem ter impactos mistos em cada grupo filogenético e na comunidade bacteriana. Aqui também descobrimos que o plástico biodegradável, PLA, não liberou compostos biodegradáveis que se refletiram em um maior crescimento ou atividade bacteriana. Isso mostra que, na água do mar, o plástico biodegradável como o PLA, nem sempre é biodegradado e seu impacto sobre os microrganismos não difere dos demais termoplásticos. Este estudo foi o primeiro passo para entender como os lixiviados plásticos podem afetar a composição da comunidade microbiana na coluna d'água. Também identificou, pela primeira vez, quais grupos bacterianos são selecionados nos lixiviados plásticos marinhos e o quanto eles são ativos na síntese de proteínas. As sondas aqui utilizadas levaram a uma ampla identificação de microrganismos, em grupos filogenéticos, que incluem muitas espécies diferentes. Portanto, novos experimentos são necessários para identificar os organismos que compõem cada grupo e seu comportamento quando expostos aos lixiviados plásticos em diferentes condições, pois muitos fatores intrínsecos e extrínsecos podem ter diferentes efeitos isolados e combinados sobre as bactérias. Este estudo melhorou nosso conhecimento atual sobre a interação entre a lixiviação de plástico e micróbios marinhos e como isso pode afetar o ambiente, a teia alimentar e o sistema marinhos. Esses resultados fornecem insights cruciais sobre potenciais formas de biodegradação de plástico que podem ser desenvolvidas no futuro.

Over 5 trillion pieces of plastic are present in the ocean. They usually contain additives that are added to them by the industry in order to improve their quality and performance. These additives and compounds, as well as the monomer blocks of the plastic, can be released into the aquatic media with consequences for the microbial community. It has been found that marine bacteria uptake the organic compounds released by plastic stimulating their growth. However, which bacterial groups are able to use them are still unknown. Therefore, the aim of this study was to characterize for the first time the bacterial community and assess its activity after the exposure to the compounds released by different types of plastics. The study tested the leachates from different types of plastic commonly found in the ocean, such as low-density polyethylene (LDPE) and polystyrene (PS), under different environmental conditions. A biodegradable plastic, polylactic acid (PLA), was also used to compare with the thermoplastic leachates. Then, the bacterial community that was able to grow in these plastic leachates was characterized by using the CARD-FISH and BONCAT techniques. Our results indicate that the bacterial community was mainly composed by Gamma-, Alphaproteobacteria and Bacteroidetes, with the first two being the dominant ones. Overall, plastic leachates increased the growth rates of Gamma- and Alphaproteobacteria in the plastic treatments compared to the controls without plastics. However, the impact on Bacteroidetes was more variable. Irradiation during plastic leaching had contrasting results on the bacterial abundance which depended on the plastic type and the phylogenetic group. On the other hand, plastic leachates that were previously irradiated increased significantly more the activity of marine bacteria compared to the non-irradiated ones. These results provide crucial insights on potential ways of plastic biodegradation that could be developed in the future.