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Standardization of a protocol for purple sea urchin (Paracentrotus lividus, Lamark 1816) sperm cryopreservation
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Advisor(s)
Abstract(s)
Aquaculture, as a result of growing seafood consumption and overexploitation of wild populations, has the potential to provide a sustainable alternative to meet market demand. This study developed reproductive strategies for the production and conservation of the purple sea urchin, Paracentrotus lividus. as this species is highly exploited for their rich content gonads, sea urchin “roe”. In that aim, three experiments were conducted to standardize a protocol for sea urchin sperm cryopreservation: the first experiment tested the optimal freezing rate using two different freezing rates, -5°C/min and -10°C/min, and which storage equipment was more adequate to pack sea urchin sperm, 500 μL straws and 1.2 mL cryovials. Our results showed that while analyzing sperm motility parameters and cell survival, treatments with -10°C/min freezing rates and straws as storage equipment produced significantly higher results, thus they were chosen for the following experiments. As cryoprotectants are one of the most important aspects when selecting a cryopreservation protocol, the second experiment tested three permeable cryoprotectants, DMSO, ethylene glycol, and methanol at different concentrations (5%, 10%, and 20%), and used sperm motility parameters, cell viability, and DNA fragmentation as tools to evaluate post-thaw sperm quality. We discovered through these tests that 20% DMSO had greater results than all the other treatments. Finally, the third experiment involved examining quality tests such as sperm motility, cell viability, DNA fragmentation, and fertilization rates after the addition of a non-permeable cryoprotectant (trehalose or sucrose). The results were clear and adding a nonpermeable cryoprotectant to 20% DMSO had no influence. Further research should be conducted to explore higher cooling rates, more sperm quality testing, and alternative combinations of permeable and nonpermeable cryoprotectants.
À medida que a população mundial cresce e o consumo de alimentos e produtos aquáticos aumenta, há uma necessidade de encontrar alternativas sustentáveis para satisfazer a crescente oferta. O Paracentrotus lividus é uma espécie de ouriço-do-mar distribuído essencialmente no Mar Mediterrâneo e no leste do Oceano Atlântico, e é uma espécie fundamental dos ecossistemas marinhos bentónicos, especialmente no Mediterrâneo, onde ajuda a manter a estabilidade ecológica. Como muitos outros seres marinhos, os ouriços-do-mar enfrentam ameaças devido a mudanças ambientais, como a alteração do meio físico e químico, competição interespecífica por recursos, poluição, destruição de habitat, e atividades humanas, como pesca excessiva para consumo humano, ou para descoberta de novos medicamentos. Um dos impactos mais preocupantes é a exploração comercial de suas gônadas (ovas de ouriço-do-mar), consideradas uma iguaria na América do Norte e do Sul, na Ásia e na Europa, especialmente no Norte. Neste contexto, a aquacultura tornou-se um excelente aliado em situações críticas onde determinadas espécies, como os ouriços-do-mar, são alvo. Consequentemente, este estudo desenvolveu estratégias reprodutivas ex situ para produção e preservação de P. lividus, padronizando um protocolo de criopreservação de esperma. No entanto este tipo de procedimentos por norma são bastante interespecíficos podendo causar danos celulares se não for eficiente, e como tal é necessário implementar testes de qualidade. Para alcançar um protocolo adequado, foi necessário realizar três experiências com diferentes objetivos. A primeira experiência, testou duas taxas de congelação diferentes, -5ºC/min e -10ºC/min, e ainda avaliou dois tipos de armazenamento, palhinhas de 0,50 ml e crioviais de 1.2 ml. Os resultados obtidos foram avaliados através de testes de mobilidade dos espermatozoides e viabilidade celular, permitindo mostrar diferenças significativas (P-value = 0.008) nos tratamentos com taxa de -10ºC/min criopreservados em palhinhas para a mobilidade progressiva bem como para a velocidade em linha reta (P-value = 0.008). Para a velocidade circular (P-value = 0.009) as diferenças significativas foram direcionadas para os tratamentos de DMSO a 10% para as duas taxas de congelação em palhinhas e ainda no coeficiente de linearidade também de observaram diferenças (P-value = 0.030) para os tratamentos armazenados em palhinhas com concentração de DMSO 5% e o DMSO 10% congelados na taxa -10ºC/min e -5ºC/min respetivamente. Contudo na mobilidade total (P-value = 0.353) e viabilidade celular (P-value = 0.407) não foram encontradas diferenças estatísticas, todavia podemos afirmar que as maiores percentagens atingidas foram nos tratamentos de palhinhas congelados na taxa de -10ºC/min (31.79± 14.21% e 29.93 ±4.56%). No geral as diferenças foram encontradas essencialmente nos tratamentos em que era utilizada a taxa de congelamento de -10ºC/min e as palhinhas como forma de armazenamento, tendo então sido posteriormente escolhidas como condições para a seguinte experiência. Para a segunda experiência foi analisado a influencia de três crioprotetores permeáveis, DMSO, etileno de glicol, e metanol, a três concentrações diferentes, 5, 10, e 20%, sendo que os seus efeitos foram avaliados por três testes de qualidade diferentes, mobilidade dos espermatozoides, viabilidade celular, e percentagem de ADN fragmentado. A escolha de um crioprotetor e concentração ideal são parâmetros essenciais no desenvolvimento de protocolos, já que este tem a capacidade de penetrar na célula e agir como mecanismo de defesa contra os danos causados pelo congelamento, que outrora poderiam ser letais para a esta. Os resultados mostraram que o DMSO 20% e o DMSO 10% obtiveram diferenças significativas na mobilidade total tendo 1.58 ± 0.21% e 1.29 ± 0.25% de espermatozoides móveis respetivamente (P-value = 0.002), por outro lado para a mobilidade progressiva não se observaram diferenças entre tratamentos (P-value = 0.074). Quando analisadas as velocidades, mais uma vez o DMSO 20% e o DMSO 10% obtiveram diferenças em relação aos outros tratamentos na velocidade em linha reta, contudo para a velocidade curvilínea não apresentaram diferenças (P-value = 0.030) entre crioprotetores e suas respetivas concentrações, assim como o coeficiente de linearidade também não apresentou (P-value = 0.471). Relativamente á viabilidade celular, o DMSO 20% e o DMSO 10% obtiveram diferenças significativas (P-value = 0.001), com o DMSO 20% a destacar-se com 53.81 ± 9.04% células viáveis, contudo na fragmentação de DNA não foram encontras diferenças (P-value = 0.289). Dado as evidencias, os tratamentos DMSO 20% e DMSO 10% foram os tratamentos que demonstraram ser mais eficazes na proteção celular, no entanto o DMSO 20% foi escolhido como crioprotetor permeável para a otimização deste protocolo. Segundo vários autores a suplementação com crioprotetores não permeáveis é benéfica para muitos seres vivos, e no caso dos invertebrados marinhos os açucares em concreto são os mais utilizados, especialmente a trealose a sacarose. Dada esta informação a terceira experiência tem como objetivo testar os efeitos da suplementação da trealose e a sacarose, com duas concentrações, 5% e 15%. Para tal, avaliou-se a mobilidade dos espermatozoides, a viabilidade celular, a percentagem de ADN fragmentado, e ainda a percentagem de ovos fertilizados. Através dos testes de qualidade, observaram-se diferenças significativas na mobilidade total (P-value = 0.006), sendo o DMSO 20% (1.22 ± 0%), o melhor tratamento, contudo os restantes parâmetros de mobilidade, de viabilidade, de fragmentação de ADN e de taxas de fertilização não apresentaram diferenças estatísticas. Ainda assim DMSO 20% suplementado com 5% de Sacarose apresentaram maiores percentagem de células viáveis (70.39 ± 11.37%), e maior taxa de fertilização (37.77 ± 9.17%). De forma sucinta, é necessário realizar mais investigações que permitam abordar as falhas deste estudo e executar em conjunto outros testes de qualidade. Estudos complementares deverão utilizar outras taxas de congelação já que diferentes autores utilizam taxas mais altas, realizar testes de toxicidade e stress oxidativo para a infabilidade dos resultados e utilizar mais pools para mitigar os erros. É essencial também testar outros crioprotetores permeáveis e não permeáveis e diferentes concentrações. Tendo em consideração os resultados aqui obtidos, concluímos que o DMSO é de facto o melhor crioprotetor, no entanto testes de toxicidade deverão ser realizados em estudos futuros para entender os seus efeitos nas taxas de fertilização. Para além disso a suplementação com açucares mostrou ser irrelevante, criando a oportunidade de testar outros crioprotetores não permeáveis. É também importante realçar que o protocolo de quantificação de fragmentação de DNA obteve incoerências e como tal futuros estudos devem insistir no melhoramento do protocolo.
À medida que a população mundial cresce e o consumo de alimentos e produtos aquáticos aumenta, há uma necessidade de encontrar alternativas sustentáveis para satisfazer a crescente oferta. O Paracentrotus lividus é uma espécie de ouriço-do-mar distribuído essencialmente no Mar Mediterrâneo e no leste do Oceano Atlântico, e é uma espécie fundamental dos ecossistemas marinhos bentónicos, especialmente no Mediterrâneo, onde ajuda a manter a estabilidade ecológica. Como muitos outros seres marinhos, os ouriços-do-mar enfrentam ameaças devido a mudanças ambientais, como a alteração do meio físico e químico, competição interespecífica por recursos, poluição, destruição de habitat, e atividades humanas, como pesca excessiva para consumo humano, ou para descoberta de novos medicamentos. Um dos impactos mais preocupantes é a exploração comercial de suas gônadas (ovas de ouriço-do-mar), consideradas uma iguaria na América do Norte e do Sul, na Ásia e na Europa, especialmente no Norte. Neste contexto, a aquacultura tornou-se um excelente aliado em situações críticas onde determinadas espécies, como os ouriços-do-mar, são alvo. Consequentemente, este estudo desenvolveu estratégias reprodutivas ex situ para produção e preservação de P. lividus, padronizando um protocolo de criopreservação de esperma. No entanto este tipo de procedimentos por norma são bastante interespecíficos podendo causar danos celulares se não for eficiente, e como tal é necessário implementar testes de qualidade. Para alcançar um protocolo adequado, foi necessário realizar três experiências com diferentes objetivos. A primeira experiência, testou duas taxas de congelação diferentes, -5ºC/min e -10ºC/min, e ainda avaliou dois tipos de armazenamento, palhinhas de 0,50 ml e crioviais de 1.2 ml. Os resultados obtidos foram avaliados através de testes de mobilidade dos espermatozoides e viabilidade celular, permitindo mostrar diferenças significativas (P-value = 0.008) nos tratamentos com taxa de -10ºC/min criopreservados em palhinhas para a mobilidade progressiva bem como para a velocidade em linha reta (P-value = 0.008). Para a velocidade circular (P-value = 0.009) as diferenças significativas foram direcionadas para os tratamentos de DMSO a 10% para as duas taxas de congelação em palhinhas e ainda no coeficiente de linearidade também de observaram diferenças (P-value = 0.030) para os tratamentos armazenados em palhinhas com concentração de DMSO 5% e o DMSO 10% congelados na taxa -10ºC/min e -5ºC/min respetivamente. Contudo na mobilidade total (P-value = 0.353) e viabilidade celular (P-value = 0.407) não foram encontradas diferenças estatísticas, todavia podemos afirmar que as maiores percentagens atingidas foram nos tratamentos de palhinhas congelados na taxa de -10ºC/min (31.79± 14.21% e 29.93 ±4.56%). No geral as diferenças foram encontradas essencialmente nos tratamentos em que era utilizada a taxa de congelamento de -10ºC/min e as palhinhas como forma de armazenamento, tendo então sido posteriormente escolhidas como condições para a seguinte experiência. Para a segunda experiência foi analisado a influencia de três crioprotetores permeáveis, DMSO, etileno de glicol, e metanol, a três concentrações diferentes, 5, 10, e 20%, sendo que os seus efeitos foram avaliados por três testes de qualidade diferentes, mobilidade dos espermatozoides, viabilidade celular, e percentagem de ADN fragmentado. A escolha de um crioprotetor e concentração ideal são parâmetros essenciais no desenvolvimento de protocolos, já que este tem a capacidade de penetrar na célula e agir como mecanismo de defesa contra os danos causados pelo congelamento, que outrora poderiam ser letais para a esta. Os resultados mostraram que o DMSO 20% e o DMSO 10% obtiveram diferenças significativas na mobilidade total tendo 1.58 ± 0.21% e 1.29 ± 0.25% de espermatozoides móveis respetivamente (P-value = 0.002), por outro lado para a mobilidade progressiva não se observaram diferenças entre tratamentos (P-value = 0.074). Quando analisadas as velocidades, mais uma vez o DMSO 20% e o DMSO 10% obtiveram diferenças em relação aos outros tratamentos na velocidade em linha reta, contudo para a velocidade curvilínea não apresentaram diferenças (P-value = 0.030) entre crioprotetores e suas respetivas concentrações, assim como o coeficiente de linearidade também não apresentou (P-value = 0.471). Relativamente á viabilidade celular, o DMSO 20% e o DMSO 10% obtiveram diferenças significativas (P-value = 0.001), com o DMSO 20% a destacar-se com 53.81 ± 9.04% células viáveis, contudo na fragmentação de DNA não foram encontras diferenças (P-value = 0.289). Dado as evidencias, os tratamentos DMSO 20% e DMSO 10% foram os tratamentos que demonstraram ser mais eficazes na proteção celular, no entanto o DMSO 20% foi escolhido como crioprotetor permeável para a otimização deste protocolo. Segundo vários autores a suplementação com crioprotetores não permeáveis é benéfica para muitos seres vivos, e no caso dos invertebrados marinhos os açucares em concreto são os mais utilizados, especialmente a trealose a sacarose. Dada esta informação a terceira experiência tem como objetivo testar os efeitos da suplementação da trealose e a sacarose, com duas concentrações, 5% e 15%. Para tal, avaliou-se a mobilidade dos espermatozoides, a viabilidade celular, a percentagem de ADN fragmentado, e ainda a percentagem de ovos fertilizados. Através dos testes de qualidade, observaram-se diferenças significativas na mobilidade total (P-value = 0.006), sendo o DMSO 20% (1.22 ± 0%), o melhor tratamento, contudo os restantes parâmetros de mobilidade, de viabilidade, de fragmentação de ADN e de taxas de fertilização não apresentaram diferenças estatísticas. Ainda assim DMSO 20% suplementado com 5% de Sacarose apresentaram maiores percentagem de células viáveis (70.39 ± 11.37%), e maior taxa de fertilização (37.77 ± 9.17%). De forma sucinta, é necessário realizar mais investigações que permitam abordar as falhas deste estudo e executar em conjunto outros testes de qualidade. Estudos complementares deverão utilizar outras taxas de congelação já que diferentes autores utilizam taxas mais altas, realizar testes de toxicidade e stress oxidativo para a infabilidade dos resultados e utilizar mais pools para mitigar os erros. É essencial também testar outros crioprotetores permeáveis e não permeáveis e diferentes concentrações. Tendo em consideração os resultados aqui obtidos, concluímos que o DMSO é de facto o melhor crioprotetor, no entanto testes de toxicidade deverão ser realizados em estudos futuros para entender os seus efeitos nas taxas de fertilização. Para além disso a suplementação com açucares mostrou ser irrelevante, criando a oportunidade de testar outros crioprotetores não permeáveis. É também importante realçar que o protocolo de quantificação de fragmentação de DNA obteve incoerências e como tal futuros estudos devem insistir no melhoramento do protocolo.
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Paracentrotus lividus Conservação Esperma Criopreservação Crioprotetores Testes de qualidade