Publication
Improvement of Chlorella sorokiniana to increase the production of lipophilic compounds
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais | |
| dc.contributor.advisor | Varela, João Carlos Serafim | |
| dc.contributor.advisor | Schüler, Lisa Maylin | |
| dc.contributor.author | Lourenço, Cristiana Isabel Rodrigues | |
| dc.date.accessioned | 2025-01-21T15:15:45Z | |
| dc.date.available | 2025-01-21T15:15:45Z | |
| dc.date.issued | 2024-11-28 | |
| dc.description.abstract | Microalgae represent a promising alternative to terrestrial plants as a natural source of bioactive compounds with anti-inflammatory and antioxidant properties. These compounds can provide health benefits and help to prevent chronic diseases, such as inflammatory bowel disease (IBD), when incorporated into functional foods, nutraceuticals, and pharmaceuticals. However, large-scale microalgae production faces challenges in ensuring economic viability. Alongside optimising process parameters, strain improvement is a promising approach to enhance productivity and fine-tune the accumulation of target compounds. The Algae4IBD project aimed at developing novel algal-based products to treat IBD, identified lipophilic extracts from Chlorella sorokiniana with high anti-inflammatory activity. Therefore, the thesis aimed to increase the production of lipophilic compounds in C. sorokiniana under heterotrophic conditions. To accomplish this, chemically induced random mutagenesis using ethyl methanesulfonate (EMS) and screening with lipid pathway inhibitors led to the isolation of several inhibitor-resistant colonies. Among them, mutant M9 emerged as the most promising strain with a light green colour, which is considered more appealing for consumers, distinguishing itself from other mutants. This novel M9 strain exhibited a specific growth rate of 1.41 ± 0.01 d−1, biomass productivity of 2.02 ± 0.07 g L−1d−1 and biomass concentration of 6.85 ± 0.12 g L−1, similar to that of the WT. In addition, as quantified by BODIPY505/515 fluorescence in flow cytometry and gravimetry, its lipid content of 18.1 ± 0.3% DW was 50% higher than the WT's, 11.8 ± 1.20% DW. A preliminary two-stage cultivation involving the induction of lipophilic compounds, through exposure to 30 g L⁻¹ sea salt and/or 140 μmol m⁻² s⁻¹ of light, did not significantly increase lipid accumulation (p > 0.05), suggesting further optimization is needed. Despite this, the promising characteristics of mutant M9, particularly its higher lipid content, make it a strong candidate for further development in the commercial production of microalgae-based products. | eng |
| dc.description.abstract | As microalgas são maioritariamente organismos fotossintéticos unicelulares, capazes de crescer em diversos ambientes, incluindo ambientes com condições extremas como, por exemplo, habitats de elevada salinidade ou temperatura. Representam, assim, uma fonte promissora com uma vasta variedade de compostos, dificilmente encontrados em plantas terrestres. Devido ao seu potencial biotecnológico, as microalgas têm vindo a ser reconhecidas como fontes diversificadas de aplicações para diferentes áreas como, por exemplo, a agricultura, indústria farmacêutica e nutracêutica ou para a produção de alimentos. Entre as microalgas, a microalga clorófita Chlorella sorokiniana consegue crescer sob condições heterotróficas. Esta condição de cultivo, em contraste com o cultivo fotoautotrófico, oferece várias vantagens. Embora o cultivo fotoautotrófico das microalgas seja necessário usar uma fonte de luz, entre elas a luz solar, para obter energia e dióxido de carbono (CO2), como fonte de carbono, por outro lado, no cultivo heterotrófico, as microalgas dependem de fontes de carbono orgânico para crescerem, como a glucose, sacarose ou acetato. Estas condições permitem uma produção mais rápida e eficiente de obter mais biomassa não dependendo da luz. Estudos indicam que, quando estão em défice de nutrientes ou da fonte de carbono, começam a acumular lípidos, o que é altamente desejável quando se pretende obter biomassa rica em lípidos para aplicações comerciais. No entanto, o cultivo de microalgas em grande escala é um processo caro, especialmente devido ao custo dos nutrientes e das condições rigorosamente controladas de cultivo. Posto isto, para tornar a produção de microalgas economicamente viável, é essencial aumentar a produtividade da biomassa e melhorar a capacidade das estirpes para acumular os compostos desejados. Uma das estratégias mais utilizadas para otimizar a sua produção é fazer melhoramento de estirpes através de processos de mutagénese aleatória. Esta técnica permite induzir mutações no DNA das microalgas, promovendo alterações genéticas aleatórias, que podem melhorar o crescimento e a produção de compostos específicos, sem a introdução de DNA exógeno, de modo a respeitar a legislação europeia referente a organismos geneticamente modificados. Este trabalho foi realizado no âmbito ao projeto Algae4IBD, onde o consórcio descobriu que a C. sorokiniana tem propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias importantes para aliviar os sintomas da doença inflamatória intestinal (IBD), uma doença crónica que causa inflamação no trato gastrointestinal. Durante este trabalho, realizou-se a mutagénese aleatória na C. sorokiniana utilizando o agente químico etil-metanossulfonato (EMS). O EMS é um agente mutagénico que provoca alterações na sequência de bases do DNA, aumentando a probabilidade da ocorrência de mutações espontâneas que naturalmente surgem de forma muito mais lenta ao longo do tempo. A mutagénese aleatória foi acoplada por uma triagem com inibidores de vias metabólicas especificas para lípidos, nomeadamente, terbinafina e cerulenina. A escolha dos inibidores teve em conta o objetivo principal do estudo: gerar uma estirpe que tenha mais compostos lipofílicos do que o WT. A terbinafina é um composto antifúngico que inibe a síntese de ergosterol, um componente essencial da membrana celular que afeta a via do esqualeno. Embora a terbinafina seja usada para tratar infeções fúngicas, também tem sido utilizada em estudos com microalgas para promover a acumulação de lípidos. Por outro lado, a cerulenina é um antibiótico que inibe a síntese de ácidos gordos, bloqueando a ação da enzima β-cetoacil-ACP sintase. Depois de espalhar as células submetidas ao EMS, em placas com terbinafina e cerulenina, começaram a surgir colónias passado alguns dias com características fenotípicas distintas como: tamanho, rapidez de crescimento e cor. As colónias que visualmente pareceram interessantes foram isoladas e validadas, replicando 10 vezes em placas contendo o inibidor. Os mutantes validados, que sobreviveram às concentrações mínimas letais do WT, evidenciam um aumento na produção de lípidos. No entanto, certos mutantes podem ter respostas diversas a esta inibição, como aconteceu com os mutantes M1 e M3, que apesar de sobreviverem às concentrações mínimas letais do WT, obtiveram uma taxa de crescimento específica significativamente mais baixa (p < 0.05) em comparação com o WT e os outros mutantes. Tendo isto em conta, é fundamental fazer a caracterização das estirpes para detetar certas alterações que ocorreram. De todos os mutantes, o M9 destacou-se devido à sua cor verde-clara. Apresentou um desempenho de crescimento semelhante ao do WT, com uma taxa de crescimento específica de 1.41 ± 0.01 d⁻¹, uma produtividade de biomassa de 2.02 ± 0.07 g L⁻¹ d⁻¹, e uma concentração final de biomassa de 6.85 g L⁻¹. Estes resultados demonstram que o M9 mantém a capacidade de crescimento eficiente em condições heterotróficas. Para além da cor, outra característica que o distingue é a sua capacidade de acumulação de lípidos. A intensidade de fluorescência observada em citometria de fluxo com o corante solvatocrómico BODIPY505/515 indicou uma acumulação de lípidos mais acentuada no M9 em comparação com o WT e os outros mutantes. A acumulação lipídica foi ainda confirmada pelo método gravimétrico de Bligh e Dyer, utilizado para a extração e quantificação de lípidos totais. O M9 apresentou 18.07 ± 0.32% de lípidos em peso seco (DW), um valor significativamente superior (p < 0.05) aos 11.82 ± 1.20% DW observados no WT. Tendo por base esses resultados, foi realizado um ensaio preliminar para induzir a acumulação de lípidos sob condições de stress através da adição de 30 g L⁻¹ de sal marinho e exposição à luz com uma intensidade de 140 μmol m⁻² s⁻¹. No entanto, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na acumulação de lípidos sob estas condições (p > 0.05), sugerindo que serão necessários mais testes para otimizar este protocolo de forma a maximizar a produção lipídica. Futuramente, este teste deve ser feito com triplicados de forma a obter resultados estatisticamente comparáveis e mais rigorosos. Contudo, o mutante M9 parece ser uma estirpe promissora para a produção comercial de compostos lipofílicos. A elevada acumulação de lípidos, aliada à capacidade de crescimento comparável ao do WT, torna-o um candidato ideal e interessante para prosseguir com o desenvolvimento de ensaios futuros de forma a obter uma quantidade substancial dos compostos desejados. Com a aplicação da sua biomassa em alimentos funcionais, nutra- ou farmacêuticos, esta estirpe é especialmente promissora para o tratamento de doenças inflamatórias como a doença inflamatória intestinal (IBD), porque existe a indicação dentro do projeto ALGAE4IBD da correlação de um maior conteúdo lipídicos com um maior potencial anti-inflamatório da biomassa algal. O sucesso destes resultados revela a importância da mutagénese aleatória acoplada aos inibidores de via metabólica específica na melhoria de estirpes, abrindo portas para uma vasta gama de oportunidades no desenvolvimento de produtos baseados em microalgas. | por |
| dc.identifier.tid | 203802470 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/26661 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Microalgas | |
| dc.subject | Cultura heterotrófica | |
| dc.subject | Melhoramento de estirpes | |
| dc.subject | Compostos lipofílicos | |
| dc.title | Improvement of Chlorella sorokiniana to increase the production of lipophilic compounds | eng |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biotecnologia |