Loading...
Publication
The BiP Chaperone from the Endoplasmic Reticulum of Zebrafish (Daniorerio) and Golden Hamster (Mesocricetus auratus)
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 1.83 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
The Hsp70 family of molecular chaperones plays a crucial role in maintaining cellular proteostasis by promoting protein folding, transport, and degradation. One of its component proteins, the binding immunoglobulin protein (BiP), is an essential endoplasmic reticulum chaperone required for proper protein folding and stress response. The primary objective of this work was to clone the open reading frame of the BiP gene from zebrafish (Danio rerio), a model organism that is frequently used to study the molecular and genetic causes of human disorders. More than 70% of the genes between humans and zebrafish are similar, including many orthologs connected to neurodegenerative illnesses like Alzheimer's. For the sake of further functional investigations, the open reading frame of the zebrafish BiP gene was amplified and inserted into a bacterial expression vector. From zebrafish, the total RNA of caudal cell lines was extracted and reverse transcribed to create complementary DNA. The target DNA sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers for BiP. The golden hamster BiP ORF was removed from the backbone pQE10, and the amplified product was cloned into the vector. After transforming the recombinant plasmid into Escherichia coli DH5α for propagation and isolation, the insertion of the open reading frame of zebrafish BiP was sent to sequencing. Unfortunately, E coli recombines the zebrafish BiP ORF, contrary to the golden hamster ORF previously cloned into the same vector. Different E coli strains deficient in DNA recombination should be tested soon. This work aimed to establish the foundation for further investigations into the activity and biochemical characteristics of zebrafish BiP and its interactions with co-chaperones and client proteins in comparison with the mammalian BiP from golden hamster. At the longer term, we want to understand how the chaperone machinery of the endoplasmic reticulum has evolved in resolving protein aggregates associated with neurodegenerative diseases.
As células possuem um conjunto de proteínas, designadas chaperones moleculares, absolutamente essenciais para assegurar a síntese de proteínas funcionais, responder a condições de stress que afetam a integridade do proteoma e direcionar proteínas danificadas para os mecanismos de reciclagem celular como o lisossoma e o proteassoma. A família de chaperones moleculares Hsp70 é das mais relevantes, desempenhando um papel crucial na manutenção da homeostase do proteoma celular (também designada proteostase). Um dos membros dessa família, o chaperone BiP (binding immunoglobulin protein), é essencial no retículo endoplasmático, a chamada via secretória das células, onde cerca de 20% do proteoma é sintetizado. Tem um papel fundamental no “folding” das proteínas no retículo endoplasmático e na resposta ao stress celular resultante do “misfolding” e agregação proteica que está associada à morte das células neuronais (neurodegeneração) em várias patologias como por exemplo a doença de Alzheimer. Em 2022, descobriu-se que a BiP, para além da função clássica de chaperone envolvido na catálise do folding de proteínas, possui a capacidade de desagregar proteínas no retículo endoplasmático (Melo et al., 2022). O estudo da capacidade da BiP para resolver agregados proteicos e impedir a sua acumulação no reticulo endoplasmático é importante para perceber os mecanismos celulares que previnem a neurodegeneração e, eventualmente, desenvolver estratégias terapêuticas para tratamento das doenças neurodegenerativas. O objetivo principal deste trabalho consistiu na clonagem da sequência codificante (designada “Open Reading Frame” – ORF) da BiP do peixe zebra (Danio rerio), num vetor adequado para expressão da proteína na bateria Escherichia coli. O peixe zebra é um organismo modelo, frequentemente usado para estudar as causas genéticas e moleculares de doenças humanas. Mais de 70% dos genes humanos e do peixe zebra são similares, incluindo muitos genes ortologos relacionados com doenças neurodegenerativas. A ORF da BiP do peixe zebra foi amplificada e inserida num vetor para expressão da proteína na bactéria E. coli. A partir do ácido ribonucleico (RNA) total extraído de uma linha celular contínua isolada da cauda do peixe zebra, sintetizou-se a cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) usando o enzima transcriptase reversa e “primers” com 18 nucleótidos timina e 6 nucleótidos aleatórios (“random hexamers”). O cDNA foi depois usado como molde, juntamente com primers específicos para a sequência alvo, para amplificar a ORF da BiP do peixe zebra pela reação de PCR (“polymerase chain reaction”). Nesta reação de PCR usou-se uma DNA polimerase à iv prova de erro e, após otimização da temperatura de hibridação dos primers, conseguiu-se amplificar a ORF da BiP do peixe zebra. Para obter maiores quantidades desta ORF, usou-se o produto desta primeira reação de amplificação, após diluição adequada, como molde para nova reação de PCR, um procedimento frequentemente designado por “nested” PCR. Antes de avançar para a clonagem da ORF da BiP do peixe zebra num vetor adequado, mandou-se sequenciar o produto de PCR para confirmar a sequência alvo. Pela análise das sequenciações obtidas para as duas cadeias complementares de DNA, em comparação com a sequência esperada (gene ID 378848 e sequencia referência NM_213058.1 do National Center for Biotechnology Information), confirmou-se que era efetivamente a ORF da BiP do peixe zebra. Confirmou-se 92% da sequência e verificou-se a presença de 9 mutações silenciosas e uma mutação que substitui o aminoácido prolina por uma leucina, na posição 374 da BiP do peixe zebra. Para clonar esta ORF no vetor pQE10 desenhado para expressão de proteínas heterologas em E. coli e com resistência ao antibiótico ampicilina, primeiro digeriu-se o vetor com os enzimas de restrição BamHI e AflII para remover a ORF da BiP de hamster sírio, previamente clonada no vetor pQE10. Depois, a ORF da BiP do peixe zebra amplificada por PCR, foi também duplamente digerida com os mesmos enzimas de restrição cujas sequências de reconhecimento e corte estavam incluídas nos primers usados na amplificação. Por fim, procedeu-se à ligação do ORF ao vetor, usando o enzima DNA ligase T4. Após transformação de células de E. coli DH5α competentes, obtiveram-se colónias que foram crescidas em meio líquido para isolamento do plasmídeo e posterior sequenciação. Inesperadamente, depois de sequenciar várias colónias, verificou-se que ocorre recombinação da ORF pelas células de E. coli DH5α. Esta recombinação resulta da sequência da ORF da BiP do peixe zebra, visto que não ocorria quando a ORF inserida no vetor era a da BiP de hamster sírio. Para solucionar este problema, vai usar-se uma estirpe de E. coli alternativa à DH5α, designada Stbl3 e recomendada para reduzir a frequência de recombinação homologa. Neste trabalho, efetuou-se ainda a expressão da ORF da BiP de hamster sírio previamente clonada no vetor pQE10 usando células de E. coli BL21(DE3) adequadas para expressão de proteínas heterólogas. Após expressão, a BiP de hamster sírio foi purificada por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC – “Immobilized metal affinity chromatography) e o grau de pureza após purificação analisado por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS_Page – “Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”). A clonagem da ORF da BiP do peixe zebra tinha como objetivo estudar a função e o mecanismo da BiP de dois vertebrados evolutivamente distantes, o peixe zebra e o hamster sírio. Pretende se no futuro, perceber se a evolução ao longo da linhagem dos vertebrados conduziu a uma BiP v mais eficiente na sua atividade de hidrólise de ATP (ATPase), na sua capacidade de catalisar o enrolamento correto de outras proteínas, na sua interação com outros co-chaperones importantes na manutenção da proteostase celular e, principalmente, na sua capacidade de resolver agregados proteicos resultantes do “misfolding” das proteínas. A longo prazo, pretende-se entender como é que a maquinaria de chaperones do retículo endoplasmático evoluiu para impedir/resolver a acumulação de agregados proteicos associados com doenças neurodegenerativas.
As células possuem um conjunto de proteínas, designadas chaperones moleculares, absolutamente essenciais para assegurar a síntese de proteínas funcionais, responder a condições de stress que afetam a integridade do proteoma e direcionar proteínas danificadas para os mecanismos de reciclagem celular como o lisossoma e o proteassoma. A família de chaperones moleculares Hsp70 é das mais relevantes, desempenhando um papel crucial na manutenção da homeostase do proteoma celular (também designada proteostase). Um dos membros dessa família, o chaperone BiP (binding immunoglobulin protein), é essencial no retículo endoplasmático, a chamada via secretória das células, onde cerca de 20% do proteoma é sintetizado. Tem um papel fundamental no “folding” das proteínas no retículo endoplasmático e na resposta ao stress celular resultante do “misfolding” e agregação proteica que está associada à morte das células neuronais (neurodegeneração) em várias patologias como por exemplo a doença de Alzheimer. Em 2022, descobriu-se que a BiP, para além da função clássica de chaperone envolvido na catálise do folding de proteínas, possui a capacidade de desagregar proteínas no retículo endoplasmático (Melo et al., 2022). O estudo da capacidade da BiP para resolver agregados proteicos e impedir a sua acumulação no reticulo endoplasmático é importante para perceber os mecanismos celulares que previnem a neurodegeneração e, eventualmente, desenvolver estratégias terapêuticas para tratamento das doenças neurodegenerativas. O objetivo principal deste trabalho consistiu na clonagem da sequência codificante (designada “Open Reading Frame” – ORF) da BiP do peixe zebra (Danio rerio), num vetor adequado para expressão da proteína na bateria Escherichia coli. O peixe zebra é um organismo modelo, frequentemente usado para estudar as causas genéticas e moleculares de doenças humanas. Mais de 70% dos genes humanos e do peixe zebra são similares, incluindo muitos genes ortologos relacionados com doenças neurodegenerativas. A ORF da BiP do peixe zebra foi amplificada e inserida num vetor para expressão da proteína na bactéria E. coli. A partir do ácido ribonucleico (RNA) total extraído de uma linha celular contínua isolada da cauda do peixe zebra, sintetizou-se a cadeia de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) usando o enzima transcriptase reversa e “primers” com 18 nucleótidos timina e 6 nucleótidos aleatórios (“random hexamers”). O cDNA foi depois usado como molde, juntamente com primers específicos para a sequência alvo, para amplificar a ORF da BiP do peixe zebra pela reação de PCR (“polymerase chain reaction”). Nesta reação de PCR usou-se uma DNA polimerase à iv prova de erro e, após otimização da temperatura de hibridação dos primers, conseguiu-se amplificar a ORF da BiP do peixe zebra. Para obter maiores quantidades desta ORF, usou-se o produto desta primeira reação de amplificação, após diluição adequada, como molde para nova reação de PCR, um procedimento frequentemente designado por “nested” PCR. Antes de avançar para a clonagem da ORF da BiP do peixe zebra num vetor adequado, mandou-se sequenciar o produto de PCR para confirmar a sequência alvo. Pela análise das sequenciações obtidas para as duas cadeias complementares de DNA, em comparação com a sequência esperada (gene ID 378848 e sequencia referência NM_213058.1 do National Center for Biotechnology Information), confirmou-se que era efetivamente a ORF da BiP do peixe zebra. Confirmou-se 92% da sequência e verificou-se a presença de 9 mutações silenciosas e uma mutação que substitui o aminoácido prolina por uma leucina, na posição 374 da BiP do peixe zebra. Para clonar esta ORF no vetor pQE10 desenhado para expressão de proteínas heterologas em E. coli e com resistência ao antibiótico ampicilina, primeiro digeriu-se o vetor com os enzimas de restrição BamHI e AflII para remover a ORF da BiP de hamster sírio, previamente clonada no vetor pQE10. Depois, a ORF da BiP do peixe zebra amplificada por PCR, foi também duplamente digerida com os mesmos enzimas de restrição cujas sequências de reconhecimento e corte estavam incluídas nos primers usados na amplificação. Por fim, procedeu-se à ligação do ORF ao vetor, usando o enzima DNA ligase T4. Após transformação de células de E. coli DH5α competentes, obtiveram-se colónias que foram crescidas em meio líquido para isolamento do plasmídeo e posterior sequenciação. Inesperadamente, depois de sequenciar várias colónias, verificou-se que ocorre recombinação da ORF pelas células de E. coli DH5α. Esta recombinação resulta da sequência da ORF da BiP do peixe zebra, visto que não ocorria quando a ORF inserida no vetor era a da BiP de hamster sírio. Para solucionar este problema, vai usar-se uma estirpe de E. coli alternativa à DH5α, designada Stbl3 e recomendada para reduzir a frequência de recombinação homologa. Neste trabalho, efetuou-se ainda a expressão da ORF da BiP de hamster sírio previamente clonada no vetor pQE10 usando células de E. coli BL21(DE3) adequadas para expressão de proteínas heterólogas. Após expressão, a BiP de hamster sírio foi purificada por cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC – “Immobilized metal affinity chromatography) e o grau de pureza após purificação analisado por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS_Page – “Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis”). A clonagem da ORF da BiP do peixe zebra tinha como objetivo estudar a função e o mecanismo da BiP de dois vertebrados evolutivamente distantes, o peixe zebra e o hamster sírio. Pretende se no futuro, perceber se a evolução ao longo da linhagem dos vertebrados conduziu a uma BiP v mais eficiente na sua atividade de hidrólise de ATP (ATPase), na sua capacidade de catalisar o enrolamento correto de outras proteínas, na sua interação com outros co-chaperones importantes na manutenção da proteostase celular e, principalmente, na sua capacidade de resolver agregados proteicos resultantes do “misfolding” das proteínas. A longo prazo, pretende-se entender como é que a maquinaria de chaperones do retículo endoplasmático evoluiu para impedir/resolver a acumulação de agregados proteicos associados com doenças neurodegenerativas.
Description
Keywords
Hsp70 family BiP (Binding Immunoglobulin Protein) Zebrafish (Danio rerio) Golden hamster (Mesocricetus auratus) Protein misfolding Neurodegenerative diseases