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Tool generation to characterize DTR1, a member of the poorly characterized DHA1 transporter family of proteins in yeast
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Advisor(s)
Abstract(s)
Nitrogen is necessary for the synthesis of a large number of compounds, such as amino acids, which are very important for several yeast dynamics, and for industrial purposes.
This project aims at the identification and characterization of new transporters involved in the excretion of amino acids through the study of a specific gene of the MFS superfamily of transporters in eukaryotes, the DTR1 gene.
In the MDR-MFS (MultiDrug Resistance-Major Facilitator Superfamily) family of proteins, up to 100 are unknown, 24 proteins are Multidrug Resistance, and may be involved in the excretion of amino acids.
DTR1 is a multi-drug resistance protein with a physiological role assigned to the yeast cell where the layers of chitosan and dityrosine on the external spore wall provide greater resistance to environmental stresses.
In the present study, techniques such as E. coli and S. cerevisiae transformation, PCR, RT-PCR, qPCR analysis were applied.
The characterization of the DTR1 gene was carried out through its location and expression using various tools, such as the Green Fluorescent Protein by observing when it is expressed in the control of its own promoter, and a fusion with the GAL1 promoter, verifying overexpression of the protein or whether the expression is normally done. The construction of the PGAL1-DTR1-GFP cassette did not occur as expected, therefore was not possible to observe the overexpression of the DTR1 gene and its location.
As for characterization on a plasmidic level, plasmids containing the GAP1 promoter were used and the promoter induced, this was possible to observe the expression analysis of the GAP1-DTR1 construction with a change of medium. Additionally, a study of the influence of glycerol and temperature, on S. cerevisiae culture was carried out where it was observed that high temperature and presence of glycerol might be stress conditions enough to DTR1 to be expressed.
O azoto é um nutriente mineral crítico em todos os organismos vivos, pois é necessário para a síntese de um grande número de compostos, incluindo hormonas, nucleotídeos e aminoácidos. Os aminoácidos são muito importantes para várias dinâmicas da levedura, como síntese de proteínas, metabolismo de hormonas, transmissão nervosa, crescimento celular, geração de energia, metabolismo do azoto e síntese de bases azotadas. Os aminoácidos também são importantes para fins industriais, como aplicações em alimentos como o aminoácidos glutamato (intensificador de sabor) ou aspartato, fenilalanina (adoçantes); para alimentação, tais como os aminoácidos lisina, metionina, treonina; e para aplicações farmacêuticas, como soluções de infusão e blocos de construção, triptofano (indutor do sono) e fenilalanina (antidepressivo). Este projeto visa a identificação e caracterização de novos transportadores envolvidos na excreção de aminoácidos por meio do estudo de um gene específico da superfamília MFS (Major Facilitator Superfamily) de compostos azotados em eucariontes, o gene DTR1. De acordo com, Sá-Correia et al., (2009) vários transportadores MDR foram identificados e estudados em diferentes organismos, particularmente aquele pertencentes à superfamília ATP-binding cassette (ABC). Um grupo de transportadores envolvidos na resistência a multidrogas menos caracterizado pertence à família MFS-MDR. Proteínas deste grupo têm vindo a receber mais atenção, maioritariamente em bactéria. Em Saccharomyces cerevisiae, a maioria dos membros desta família foi apenas descobertos aquando revelada a sequencia genómica desta levedura e caracterizados em alguns aspetos nos últimos 12 anos. A família MDR-MFS (Multidrug Resistance-Major Facilitator Superfamily) de proteínas tem aproximadamente 300 proteínas transportadoras de membrana, com até 100 sendo desconhecidas. 24 proteínas são MDR da superfamília MFS, algumas delas podem estar envolvidas na excreção de aminoácidos, como DTR1. Dentro da DHA1 (Drug: H+ antiporter family 1) que é composta por 46 proteínas, sete genes são individualmente necessários para conferir resistência à quinidina, um fármaco antiarrítmico e anti malária, entre esses genes encontram-se os genes AQR1, TPO1 e DTR1. Estes sete transportadores podem, também, proteger a célula contra outros compostos que estão normalmente ausentes no ambiente natural de células de levedura e poderão ter substratos fisiológicos específicos, onde fármacos são transportados fortuitamente ou oportunisticamente. Ainda na família DHA1, 9 proteínas mostraram ser bombas de multirresistência, 15 são provavelmente bombas de efluxo específicas para drogas e 22 são proteínas hipotéticas ou não caracterizadas. Os genes de resistência a múltiplas drogas, isto é, a aquisição simultânea de resistência a uma variedade de químicos citotóxicos, é encontrada numa grande variedade de organismos, desde bactérias a mamíferos, e isto poderá causa um severo problema clínico, principalmente no tratamento de cancros humanos e infeções de origem bacteriana e fúngica, tendo atingido proporções alarmantes nos últimos anos. DTR1 é a primeira proteína de resistência a múltiplas drogas da superfamília de facilitadores principais com um papel fisiológico atribuído na célula de levedura, mas o transporte por DTR1p pode não ser restrito ao seu substrato natural, bisformil ditirosina. As camadas de quitosana e ditirosina da parede externa dos esporos conferem maior resistência a estresses ambientais no esporo, incluindo a capacidade de passar pelo trato digestivo dos insetos, permitindo a dispersão para o meio ambiente. No presente estudo é realizada a caraterização do gene DTR1 através da sua localização e expressão com recurso a variadas ferramentas, tais como a proteína Green Fluorescent Protein, produzida pelo cnidário Aequorea victoria que emite fluorescência na zona verde do espectro visível, observando quando esta está a ser expressa no controle de seu próprio promoter. Uma fusão com o promotor Gal1, um operão procariótico que codifica as enzimas necessárias para o metabolismo da galactose, para verificar a sobrexpressão da proteína ou se a expressão é feita normalmente como no seu estado natural. Com essas fusões podemos analisar se a proteína está bem expressa, superexpressa e onde ela ocorre na célula e, usando plasmídeos identificados como GAP1 e UGA4 ambos contendo o promotor GAP1, ativado pela falta de azoto, para observação do comportamento do gene em estudo. Essas ferramentas contribuem para a caracterização a nível genómico e plasmídico da proteína de interesse, DTR1, para compreender sua função e localização no genoma da levedura. O objetivo principal deste trabalho foi construir uma cassete combinando primers para o plasmídeo, primeiro e para localização do DTR1 foi utilizado o plasmídeo PKT140, que contém a proteína GFP e resistência à canamicina. Os primers construídos são homólogos à proteína GFP, no caso do F5, e à resistência à canamicina, no caso do primer R3. A estratégia adotada foi a utilização de um fragmento do plasmídeo contendo os primers, GFP e a resistência à canamicina, que foi amplificado com um tamanho esperado de 2515 pares de bases e transformado em S. cerevisiae. A tag GFP foi aplicada a jusante do gene de interesse, DTR1. A canamicina foi usada como marca de seleção no momento da transformação e a integração no genoma da levedura foi concluída por recombinação homóloga. Para compreender se a proteína de interesse, DTR1, está a ser superexpressa, um fragmento do plasmídeo PGAL1 foi usado, novamente os primers foram construídos contendo parte de DTR1 e o promoter Gal1 no caso do iniciador R2 e parte de DTR1 e resistência à nourseotricina em o caso do primer F4. Para análise deste estudo recorreu-se a técnicas como transformação em E. coli e em S. cerevisiae, digestão com recurso a enzimas de restrição, PCR, RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR), análise de expressão por qPCR (Quantitative Real Time PCR), Cross-feeding e ainda Western Blotting. O fragmento do plasmídeo mais primers foi amplificado por PCR com 1850 pares de bases e a integração no genoma da levedura é feita por recombinação homóloga. A nível funcional concluímos que não foi possível a construção da cassete PGAL1-DTR1-GFP tendo sido efetuadas várias tentativas da mesma não tendo sido possível a observação da sobrexpressão do gene DTR1 e a sua localização. A nível plasmídico foi possível uma observação de analise de expressão de diferentes estudos de comportamento da construção GAP1-DTR1 com alteração de meio. Foi ainda feito um estudo de influência do glicerol e temperatura em cultura de S. cerevisiae em meio mínimo. Tendo em conta que o gene DTR1 faz parte da reprodução de S. cerevisiae através esporulação em condições de stress, verificou-se que uma temperatura de 30ºC e glicerol 10% poderão representar condições de stress suficientes para que este gene seja expresso.
O azoto é um nutriente mineral crítico em todos os organismos vivos, pois é necessário para a síntese de um grande número de compostos, incluindo hormonas, nucleotídeos e aminoácidos. Os aminoácidos são muito importantes para várias dinâmicas da levedura, como síntese de proteínas, metabolismo de hormonas, transmissão nervosa, crescimento celular, geração de energia, metabolismo do azoto e síntese de bases azotadas. Os aminoácidos também são importantes para fins industriais, como aplicações em alimentos como o aminoácidos glutamato (intensificador de sabor) ou aspartato, fenilalanina (adoçantes); para alimentação, tais como os aminoácidos lisina, metionina, treonina; e para aplicações farmacêuticas, como soluções de infusão e blocos de construção, triptofano (indutor do sono) e fenilalanina (antidepressivo). Este projeto visa a identificação e caracterização de novos transportadores envolvidos na excreção de aminoácidos por meio do estudo de um gene específico da superfamília MFS (Major Facilitator Superfamily) de compostos azotados em eucariontes, o gene DTR1. De acordo com, Sá-Correia et al., (2009) vários transportadores MDR foram identificados e estudados em diferentes organismos, particularmente aquele pertencentes à superfamília ATP-binding cassette (ABC). Um grupo de transportadores envolvidos na resistência a multidrogas menos caracterizado pertence à família MFS-MDR. Proteínas deste grupo têm vindo a receber mais atenção, maioritariamente em bactéria. Em Saccharomyces cerevisiae, a maioria dos membros desta família foi apenas descobertos aquando revelada a sequencia genómica desta levedura e caracterizados em alguns aspetos nos últimos 12 anos. A família MDR-MFS (Multidrug Resistance-Major Facilitator Superfamily) de proteínas tem aproximadamente 300 proteínas transportadoras de membrana, com até 100 sendo desconhecidas. 24 proteínas são MDR da superfamília MFS, algumas delas podem estar envolvidas na excreção de aminoácidos, como DTR1. Dentro da DHA1 (Drug: H+ antiporter family 1) que é composta por 46 proteínas, sete genes são individualmente necessários para conferir resistência à quinidina, um fármaco antiarrítmico e anti malária, entre esses genes encontram-se os genes AQR1, TPO1 e DTR1. Estes sete transportadores podem, também, proteger a célula contra outros compostos que estão normalmente ausentes no ambiente natural de células de levedura e poderão ter substratos fisiológicos específicos, onde fármacos são transportados fortuitamente ou oportunisticamente. Ainda na família DHA1, 9 proteínas mostraram ser bombas de multirresistência, 15 são provavelmente bombas de efluxo específicas para drogas e 22 são proteínas hipotéticas ou não caracterizadas. Os genes de resistência a múltiplas drogas, isto é, a aquisição simultânea de resistência a uma variedade de químicos citotóxicos, é encontrada numa grande variedade de organismos, desde bactérias a mamíferos, e isto poderá causa um severo problema clínico, principalmente no tratamento de cancros humanos e infeções de origem bacteriana e fúngica, tendo atingido proporções alarmantes nos últimos anos. DTR1 é a primeira proteína de resistência a múltiplas drogas da superfamília de facilitadores principais com um papel fisiológico atribuído na célula de levedura, mas o transporte por DTR1p pode não ser restrito ao seu substrato natural, bisformil ditirosina. As camadas de quitosana e ditirosina da parede externa dos esporos conferem maior resistência a estresses ambientais no esporo, incluindo a capacidade de passar pelo trato digestivo dos insetos, permitindo a dispersão para o meio ambiente. No presente estudo é realizada a caraterização do gene DTR1 através da sua localização e expressão com recurso a variadas ferramentas, tais como a proteína Green Fluorescent Protein, produzida pelo cnidário Aequorea victoria que emite fluorescência na zona verde do espectro visível, observando quando esta está a ser expressa no controle de seu próprio promoter. Uma fusão com o promotor Gal1, um operão procariótico que codifica as enzimas necessárias para o metabolismo da galactose, para verificar a sobrexpressão da proteína ou se a expressão é feita normalmente como no seu estado natural. Com essas fusões podemos analisar se a proteína está bem expressa, superexpressa e onde ela ocorre na célula e, usando plasmídeos identificados como GAP1 e UGA4 ambos contendo o promotor GAP1, ativado pela falta de azoto, para observação do comportamento do gene em estudo. Essas ferramentas contribuem para a caracterização a nível genómico e plasmídico da proteína de interesse, DTR1, para compreender sua função e localização no genoma da levedura. O objetivo principal deste trabalho foi construir uma cassete combinando primers para o plasmídeo, primeiro e para localização do DTR1 foi utilizado o plasmídeo PKT140, que contém a proteína GFP e resistência à canamicina. Os primers construídos são homólogos à proteína GFP, no caso do F5, e à resistência à canamicina, no caso do primer R3. A estratégia adotada foi a utilização de um fragmento do plasmídeo contendo os primers, GFP e a resistência à canamicina, que foi amplificado com um tamanho esperado de 2515 pares de bases e transformado em S. cerevisiae. A tag GFP foi aplicada a jusante do gene de interesse, DTR1. A canamicina foi usada como marca de seleção no momento da transformação e a integração no genoma da levedura foi concluída por recombinação homóloga. Para compreender se a proteína de interesse, DTR1, está a ser superexpressa, um fragmento do plasmídeo PGAL1 foi usado, novamente os primers foram construídos contendo parte de DTR1 e o promoter Gal1 no caso do iniciador R2 e parte de DTR1 e resistência à nourseotricina em o caso do primer F4. Para análise deste estudo recorreu-se a técnicas como transformação em E. coli e em S. cerevisiae, digestão com recurso a enzimas de restrição, PCR, RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR), análise de expressão por qPCR (Quantitative Real Time PCR), Cross-feeding e ainda Western Blotting. O fragmento do plasmídeo mais primers foi amplificado por PCR com 1850 pares de bases e a integração no genoma da levedura é feita por recombinação homóloga. A nível funcional concluímos que não foi possível a construção da cassete PGAL1-DTR1-GFP tendo sido efetuadas várias tentativas da mesma não tendo sido possível a observação da sobrexpressão do gene DTR1 e a sua localização. A nível plasmídico foi possível uma observação de analise de expressão de diferentes estudos de comportamento da construção GAP1-DTR1 com alteração de meio. Foi ainda feito um estudo de influência do glicerol e temperatura em cultura de S. cerevisiae em meio mínimo. Tendo em conta que o gene DTR1 faz parte da reprodução de S. cerevisiae através esporulação em condições de stress, verificou-se que uma temperatura de 30ºC e glicerol 10% poderão representar condições de stress suficientes para que este gene seja expresso.
Description
Keywords
Mfs-mdr DTR1 Saccharomyces cerevisiae GFP Pgal1