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Characterization of bacteria in seafood and environmental waters samples from Namibe (Angola)
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Authors
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Abstract(s)
Foodborne diseases are a major burden worldwide and are very common and one of the major causes of death in underdeveloped countries. Coliform bacteria are a non-taxonomic group of Enterobacterales order that commonly inhabit the intestines of warm-blooded animals. While most coliform bacteria are not associated with foodborne illness, there are coliforms (faecal origin) that can cause diseases in humans of which most cases are associated with pathogenic E. coli strains. Therefore, detection of coliforms is commonly used as an indirect measure of quality control and safety of foods and waters for human consumption. The present study aimed to isolate and characterise coliform bacteria from bivalves that are used for human consumption and from their environmental seawater to identify species that may represent a potential risk for human health. Four different locations (Mucoio, Praia das Conchas, Sacomar, and Praia Amélia) in the coast of Namibe in Angola were sampled and microbiology techniques, molecular analysis, biochemical and virulence assays were performed to characterise the different isolates. Our results revealed that isolates correspond to Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp. and Citrobacter freundii and that the mussels collected from Praia das Conchas showed the highest fecal coliform contamination and diversity. At least 6 different strains of E. coli, 4 of Enterobacter spp. and 2 Klebsiella spp. and 1 of Citrobacter freundii were found and they show different resistance to cephalosporins and penicillins which are common antibiotics used in clinical. Virulence tests were performed using a representative strain from each species using the arthropod model Galleria mellonella and suggest that all strains are likely to be pathogenic and most or the larvae were death in the first 24h post injection. This study identify for the first time pathogenic coliforms bacteria in bivalve food samples and environmental waters from Namibe which may represent a health risk to the local population and the major causative agents of foodborne and other diseases.
As doenças de origem alimentar têm um grande impacto no mundo estima-se que por ano existam cerce de 600 milhões de doenças de origem alimentar, levando a cerca de 420 mil morte anuais. Estas podem ser causadas devido ao consumo de alimentos crus ou mal cozinhados contaminados com microrganismos patogénicos (mais comuns) ou devido à presença de toxinas. De acordo com a Organização Mundial de Saúde os principais microrganismos causadores de doenças de origem alimentar são Vibrios spp. Listeria monocytogenes, Campylobacter, alguns serovars de Salmonela, e algumas estirpes patogénicas de Escherichia coli (E. coli) mas existem também alguns vírus como o Norovírus e o vírus da Hepatite e alguns parasitas Este trabalho é focada nas pertencentes à ordem das Enterobacterales que inclui Salmonela e E. coli. Bactérias pertencentes à ordem das Enterobacterales são bactérias Gram-negativas em forma de bastonete, esta é uma das maiores ordens do reino das bactérias contendo cerca de 60 géneros e mais de 100 espécies. Uma das principais famílias desta ordem de bactérias é a família das Enterobacteriaceae que é uma família com uma grande diversidade de bactérias. Alguns membros desta família fazem parte do microbiota dos intestinos de animais de sangue quente, fazendo parte de 1% da microbiota intestinal do corpo humano. Os coliformes são um grupo não-taxonómico de bactérias pertencente à ordem das Enterobacterales. Este tipo de bactérias é característica de fermentar a lactose e por crescer a temperaturas de 37ºC e a sua deteção em águas e comida utilizadas para consumo humano é utilizado como um método de deteção de bactérias fecais de forma a prevenir a contaminação de água e alimentos. Dentro do grupo dos coliformes existem os coliformes fecais, que crescem a cerca de 44, 5ºC e que são exemplo as bactérias Enterobacter spp., Klebsiella spp. e Citrobacter spp., e Escherichia coli (E. coli) que é a amais comum utilizada como indicador de contaminação. Estas bactérias são responsáveis por causar alguns tipos de infeções como infeções nosocomiais e urinárias e doenças de origem alimentar, uma vez que podem ser encontradas em diferentes habitats como água e solo como diferentes fontes de contaminações. De forma a evitar contaminações por coliforme é necessário uma boa monotorização e controlo de contaminação por coliformes. Este trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar 13 isolados de coliformes obtidos através de amostras de água e de tecido de mexilhão provenientes da província do Namibe em Angola. Os isolados identificados incluem 6 isolado de E. coli, 4 isolados de Enterobacter spp., 2 isolados de Klebsiella spp. e 1 isolado de Citrobacter freundii. A identificação destes isolados foi realizada utilizando 3 diferentes abordagens, uma abordagem microbiológica que também foi utilizada para purificar os isolados dos stocks de glicerol através de meios de cultura seletivos como o meio de cultura de MacConkey, que é um meio selectivo para coliformes ma vez que serve para diferenciar a fermentação de lactose. O meio coliforme Chromogenic Agar, permite diferenciar alguns tipos de coliformes através da diferente coloração das colónias. Uma abordagem molecular através da amplificação do gene do 16S e comparação das sequências nucleotídicas com a base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI). E por última foi realizada uma abordagem Bioquímica onde foram utilizadas as galerias Rapid-One da Remell, estes ensaios enzimáticos permitiram também compreender algumas diferenças metabólicas entre os vários isolados. Existirem 3 isolados dos 13 isolados de coliformes em que as 3 abordagens utilizadas para identificar não estiveram de acordo. Desta forma foi escolhida a identificação utilizada pelo o gene 16S. Foi realizada uma caracterização nos 13 isolados onde foram feitos vários ensaios como curvas de crescimento, ensaios bioquímicos. Estes ensaios permitiram compreender que isolados do mesmo género são diferentes entre si. Foram realizados alguns ensaios de forma a compreender a patogenicidade dos isolados como a deteção de pathotypes para isolados de E. coli, no entanto não foi possível detetar os pathotypes dos isolados. Foi realizado o ensaio hemolítico que teve como objectivo compreender o tipo de atividade hemolítico dos isolados, todos os isolados apresentaram uma atividade hemolítica gama, isto é não existe destruição de eritrócitos. Foram realizados antibiogramas de forma a compreender genes de resistência a antibióticos que os isolados pudessem ter. A Organização Mundial de Saúde alerta como grupo crítico bactérias da ordem das Enterobacterales apresentam resistência a Carbapenemos e Cefalosporinas de 3º geração. Neste estudo alguns isolados apresentaram resistência a cefalosporinas, no entanto nenhum dos isolados apresentou resistência a antibióticos da classe dos carbapenemos. Foram realizados ensaios de virulência utilizando o modelo animal Galleria mellonella foi testada a virulência de 1 isolado de cada género isolado, todos os isolados aparentaram ser patogénicos uma vez que todas as larvas injetadas morreram ao final de 24h, à excepção dos isolados de E. coli que ao final de 24h tiveram uma taxa de sobrevivência de 3,33%. Em suma, este estudo permitiu também compreender que o local de amostragem com maior abudância de maior diversidade de coliformes foi o local de amostragem Praia das Conchas, o local de amostragem Mucoio foi o local onde foram isolados menos coliformes. Os 13 isolados coliformes aparentam ser diferentes entre os vários géneros devido aos diversos ensaios realizados. Alguns isolados apresentaram resistência a cefalosporinas e penicelinas nos antibiogramas realizados. Os isolados em que foram testados os ensaios de virulência aparentaram ser virulentos. A caracterização realizada neste ensaio permitiu identificar e compreender algumas característica, no entanto mais ensaios necessitam de ser realizados assim como a realização de uma sequenciação do genoma que permitirá perceber os vários genes de virulência e resistência a antibióticos dos isolados.
As doenças de origem alimentar têm um grande impacto no mundo estima-se que por ano existam cerce de 600 milhões de doenças de origem alimentar, levando a cerca de 420 mil morte anuais. Estas podem ser causadas devido ao consumo de alimentos crus ou mal cozinhados contaminados com microrganismos patogénicos (mais comuns) ou devido à presença de toxinas. De acordo com a Organização Mundial de Saúde os principais microrganismos causadores de doenças de origem alimentar são Vibrios spp. Listeria monocytogenes, Campylobacter, alguns serovars de Salmonela, e algumas estirpes patogénicas de Escherichia coli (E. coli) mas existem também alguns vírus como o Norovírus e o vírus da Hepatite e alguns parasitas Este trabalho é focada nas pertencentes à ordem das Enterobacterales que inclui Salmonela e E. coli. Bactérias pertencentes à ordem das Enterobacterales são bactérias Gram-negativas em forma de bastonete, esta é uma das maiores ordens do reino das bactérias contendo cerca de 60 géneros e mais de 100 espécies. Uma das principais famílias desta ordem de bactérias é a família das Enterobacteriaceae que é uma família com uma grande diversidade de bactérias. Alguns membros desta família fazem parte do microbiota dos intestinos de animais de sangue quente, fazendo parte de 1% da microbiota intestinal do corpo humano. Os coliformes são um grupo não-taxonómico de bactérias pertencente à ordem das Enterobacterales. Este tipo de bactérias é característica de fermentar a lactose e por crescer a temperaturas de 37ºC e a sua deteção em águas e comida utilizadas para consumo humano é utilizado como um método de deteção de bactérias fecais de forma a prevenir a contaminação de água e alimentos. Dentro do grupo dos coliformes existem os coliformes fecais, que crescem a cerca de 44, 5ºC e que são exemplo as bactérias Enterobacter spp., Klebsiella spp. e Citrobacter spp., e Escherichia coli (E. coli) que é a amais comum utilizada como indicador de contaminação. Estas bactérias são responsáveis por causar alguns tipos de infeções como infeções nosocomiais e urinárias e doenças de origem alimentar, uma vez que podem ser encontradas em diferentes habitats como água e solo como diferentes fontes de contaminações. De forma a evitar contaminações por coliforme é necessário uma boa monotorização e controlo de contaminação por coliformes. Este trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar 13 isolados de coliformes obtidos através de amostras de água e de tecido de mexilhão provenientes da província do Namibe em Angola. Os isolados identificados incluem 6 isolado de E. coli, 4 isolados de Enterobacter spp., 2 isolados de Klebsiella spp. e 1 isolado de Citrobacter freundii. A identificação destes isolados foi realizada utilizando 3 diferentes abordagens, uma abordagem microbiológica que também foi utilizada para purificar os isolados dos stocks de glicerol através de meios de cultura seletivos como o meio de cultura de MacConkey, que é um meio selectivo para coliformes ma vez que serve para diferenciar a fermentação de lactose. O meio coliforme Chromogenic Agar, permite diferenciar alguns tipos de coliformes através da diferente coloração das colónias. Uma abordagem molecular através da amplificação do gene do 16S e comparação das sequências nucleotídicas com a base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI). E por última foi realizada uma abordagem Bioquímica onde foram utilizadas as galerias Rapid-One da Remell, estes ensaios enzimáticos permitiram também compreender algumas diferenças metabólicas entre os vários isolados. Existirem 3 isolados dos 13 isolados de coliformes em que as 3 abordagens utilizadas para identificar não estiveram de acordo. Desta forma foi escolhida a identificação utilizada pelo o gene 16S. Foi realizada uma caracterização nos 13 isolados onde foram feitos vários ensaios como curvas de crescimento, ensaios bioquímicos. Estes ensaios permitiram compreender que isolados do mesmo género são diferentes entre si. Foram realizados alguns ensaios de forma a compreender a patogenicidade dos isolados como a deteção de pathotypes para isolados de E. coli, no entanto não foi possível detetar os pathotypes dos isolados. Foi realizado o ensaio hemolítico que teve como objectivo compreender o tipo de atividade hemolítico dos isolados, todos os isolados apresentaram uma atividade hemolítica gama, isto é não existe destruição de eritrócitos. Foram realizados antibiogramas de forma a compreender genes de resistência a antibióticos que os isolados pudessem ter. A Organização Mundial de Saúde alerta como grupo crítico bactérias da ordem das Enterobacterales apresentam resistência a Carbapenemos e Cefalosporinas de 3º geração. Neste estudo alguns isolados apresentaram resistência a cefalosporinas, no entanto nenhum dos isolados apresentou resistência a antibióticos da classe dos carbapenemos. Foram realizados ensaios de virulência utilizando o modelo animal Galleria mellonella foi testada a virulência de 1 isolado de cada género isolado, todos os isolados aparentaram ser patogénicos uma vez que todas as larvas injetadas morreram ao final de 24h, à excepção dos isolados de E. coli que ao final de 24h tiveram uma taxa de sobrevivência de 3,33%. Em suma, este estudo permitiu também compreender que o local de amostragem com maior abudância de maior diversidade de coliformes foi o local de amostragem Praia das Conchas, o local de amostragem Mucoio foi o local onde foram isolados menos coliformes. Os 13 isolados coliformes aparentam ser diferentes entre os vários géneros devido aos diversos ensaios realizados. Alguns isolados apresentaram resistência a cefalosporinas e penicelinas nos antibiogramas realizados. Os isolados em que foram testados os ensaios de virulência aparentaram ser virulentos. A caracterização realizada neste ensaio permitiu identificar e compreender algumas característica, no entanto mais ensaios necessitam de ser realizados assim como a realização de uma sequenciação do genoma que permitirá perceber os vários genes de virulência e resistência a antibióticos dos isolados.
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Keywords
Feacal coliforms Enterobacterales Foodborne diseases Bivalves Seawater Namibe