A participação dos genes mreB e spl no processo autolítico de Listeria monocytogenes

Lapa, Ana Bárbara Malta da Costa

http://hdl.handle.net/10400.1/3728

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Tese Mestrado Listeria corrigida.pdf		1.48 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Lapa, Ana Bárbara Malta da Costa

Advisor(s)

Faleiro, Maria Leonor

Abstract(s)

A bactéria Listeria monocytogenes é o agente etiológico da listeriose, uma doença fundamentalmente associada ao consumo de alimentos contaminados com esta bactéria. Os grupos de risco incluem idosos, doentes imunocomprometidos, grávidas, fetos e crianças. A frequência desta doença é baixa, mas a taxa de mortalidade é relativamente elevada, cerca de 30%. Esta bactéria tem uma capacidade extraordinária para sobreviver em ambientes bastante adversos; elevados teores de sais minerais, em particular sal, baixos valores de pH, temperaturas baixas, entre outros. Como a maioria das bactérias possui enzimas que degradam o peptidoglicano (genéricamente denominadas de muramidases) que podem comprometer a sobrevivência da célula bacteriana se a sua actividade deixar de ser regulada. Durante estudos recentes sobre a autólise em L. monocytogenes foi verificado que uma enzima, a MreB, que tem sido relacionada com a aquisição da forma bacilar aparecia em quantidades significativas no secretoma de uma estirpe não autolitica (EGD). De modo a clarificar o seu papel no comportamento autolitico foi realizada a mutagénese do gene mreB. Para além da enzima MreB foi ainda detectada uma produção significativamente elevada de uma autolisina, a Spl no secretoma da estirpe autolitica (C897). Com o objectivo de verificar a sua participação no comportamento autolitico foi igualmente realizada a mutagénese do gene spl. A mutagénese foi realizada por recombinação homóloga para os dois genes em estudo. O mutante do gene mreB da estirpe EGD ficou com o crescimento afectado em meio definido e perdeu a forma bacilar. Através de coloração com um derivado fluorescente da vancomicina verificou-se que a síntese de peptidoglicano se concentra no local do septo de divisão e sob a acção da penicilina o mutante exibiu maior resistência à lise, provavelmente devido à acumulação de proteínas “penicillin binding proteins”, PBP‟s que puderam realizar a transpeptidação. Não foi possível obter um mutante no gene mreB com a estirpe C897. Este obstáculo foi colmatado através da utilização de uma fusão de transcrição com uma proteína fluorescente verde e o gene mreB com um promotor induzido por IPTG, o pMUTINGFP+. Os resultados demonstraram que a proteína MreB não contribui para o comportamento autolitico. A mutagénese do gene spl, em ambas as estirpes, resultou numa maior resistência à lise, pelo que a sua actividade contribui para o comportamento autolitico. vii Os ensaios de invasão realizados com células NIH 3T3 demonstraram que a estirpe autolitica é significativamente mais invasiva, mas não se encontraram diferenças significativas entre os mutantes.