Thermotolerance acquisition in industrial microalgal strains to sustain growth in environments under climate change

Lima, Mariana da Silva

Publication

Thermotolerance acquisition in industrial microalgal strains to sustain growth in environments under climate change

2024-08-11Master thesis

datacite.subject.fos	Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais
dc.contributor.advisor	Varela, João Carlos Serafim
dc.contributor.advisor	Schüler, Lisa Maylin
dc.contributor.author	Lima, Mariana da Silva
dc.date.accessioned	2025-04-15T14:48:55Z
dc.date.available	2025-04-15T14:48:55Z
dc.date.issued	2024-08-11
dc.description.abstract	As microalgas e as cianobactérias constituem um grupo diversificado de organismos, predominantemente fotossintéticos, que podem ser encontrados em diversos ambientes e desempenham um papel crucial nos ecossistemas aquáticos. Como produtores primários, as microalgas não só estão na base das cadeias alimentares de vários organismos, como contribuem significativamente para a produção global de oxigénio e para a fixação de dióxido de carbono. Além disto, possuem um perfil bioquímico rico, produzindo compostos com propriedades antioxidantes, antibacterianas, antivirais e outras propriedades bioativas, o que as torna valiosas para as indústrias farmacêutica, cosmética, alimentar e dos biocombustíveis. Dentro das microalgas, as diatomáceas representam um dos maiores grupos, com mais de 20.000 espécies. Consistem em organismos eucarióticos unicelulares, do filo Bacillariophyta, e estão amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos. Uma característica peculiar destas microalgas são as suas paredes celulares porosas de sílica, denominadas frústulas, que apresentam padrões específicos para cada espécie. Em relação à sua composição bioquímica, as diatomáceas são ricas em proteínas, ácidos gordos (nomeadamente em ácido eicosapentenóico [EPA] e ácido docosahexenóico [DHA]), polissacáridos (crisolaminarina) e carotenoides (fucoxantina), tornando-as organismos de grande interesse comercial para várias indústrias. No que toca à sensibilidade às temperaturas, as diatomáceas têm preferência por temperaturas mais baixas, sendo a primavera a estação mais favorável ao seu crescimento. A sensibilidade destes organismos ao aumento das temperaturas constitui uma limitação ao seu cultivo, principalmente em sistemas abertos. Com as projeções a apontarem para um aumento de 1,8 ºC a 4,0 °C até ao final do século, as diatomáceas ficam suscetíveis aos efeitos das alterações climáticas. Este fenómeno provoca uma redução das taxas de crescimento e da produtividade, além de alterações no perfil bioquímico das algas, podendo culminar na morte celular. Neste sentido, o melhoramento de estirpes surgiu como uma ferramenta biotecnológica que permite melhorar características de interesse nos organismos, obtendo assim estirpes com maior resistência ao stress térmico. As duas principais estratégias para o melhoramento de estirpes são a engenharia genética/metabólica e a mutagénese aleatória. A engenharia genética envolve edições específicas do genoma para melhorar as caraterísticas, enquanto a mutagénese aleatória expõe as microalgas a agentes mutagénicos químicos ou físicos, como o metanossulfonato de etilo (EMS) ou radiação ultravioleta (UV), capazes de provocar alterações irreversíveis em vários locais do seu genoma. A mutagénese aleatória consiste num método robusto, fácil de executar e económico para gerar estirpes melhoradas e apresenta uma série de vantagens comparado à engenharia genética. Primeiramente, a mutagénese aleatória não requer um conhecimento prévio do genoma e das vias biossintéticas do organismo. Além disso, os mutantes gerados não estão sujeitos aos mesmos regulamentos rigorosos que os organismos geneticamente modificados na indústria alimentar na Europa e em muitas outras regiões, uma vez que não contêm qualquer ADN exógeno integrado no seu genoma. Após a mutagénese, os mutantes são selecionados para as caraterísticas desejadas, como a resistência ao calor ou o aumento da produção de compostos de interesse, através da aplicação de stress abiótico (por exemplo, temperatura, salinidade e pH) ou inibidores de vias metabólicas (como a difenilamina [DPA], a nicotina, o norflurazon, e a cerulenina). A citometria de fluxo é uma ferramenta sensível e precisa para análise de alto rendimento das propriedades individuais das células, revelando ter um grande potencial na investigação das microalgas. Esta tecnologia permite a seleção e isolamento eficaz de mutantes com caraterísticas específicas, como por exemplo para aumento da produção de compostos. Adicionalmente, através do uso de corantes fluorescentes, é possível fazer uma avaliação rápida da viabilidade celular com base na integridade da membrana ou na atividade metabólica da célula. A dissertação teve dois objetivos principais: o primeiro, isolamento de estirpes termotolerantes da diatomácea Phaeodactylum tricornutum via mutagénese aleatória; e o segundo, expansão do conhecimento sobre a relação entre a aquisição de termotolerância em diatomáceas e a salinidade do meio. Para além dos objetivos já referidos, a dissertação procurou avaliar possíveis melhorias na qualidade e valor da biomassa em resultado do stress imposto. Devido à dificuldade de cultivo de P. tricornutum em meio sólido, foi ainda avaliada a eficácia do uso da fluorescência da clorofila como forma de medição da viabilidade das microalgas cultivadas em meios líquidos. Deste modo, duas estirpes de P. tricornutum – a estirpe selvagem (WT) e um mutante previamente isolado (MT009) – foram expostas a diferentes salinidades (5, 20 e 35 ppt) e temperaturas (20, 28, 30, 35 e 40 ºC). Estes ensaios de crescimento foram realizados em de Erlenmeyer de 250 mL e, posteriormente, foi realizado o scale-up para biorreatores de 1 L, equipados com um sistema de arejamento. Na etapa de scale-up apenas as condições de 20 ºC/20 ppt, para os controlos WT e MT009, e 28 ºC a 5, 20 e 35 ppt, para a estirpe MT009, foram testadas. A biomassa das diferentes condições de crescimento obtida do ensaio em biorreatores foi posteriormente analisada bioquimicamente, nomeadamente o seu perfil de macronutrientes (proteínas, lípidos, carboidratos e cinzas), de pigmentos (clorofila a e carotenoides) e de ácidos gordos. Para alcançar o primeiro objetivo, foi efetuada a mutagénese aleatória com EMS (100, 150, 200, 250, e 300 mM), seguida de seleção de mutantes através da resistência ao stress térmico (30 ºC) e concentrações de DPA sub-letais (50, 60, e 70 μM). O ensaio da viabilidade celular foi realizado em microplacas de 24 poços e foi dividido em duas experiências, nas quais foram usadas diferentes concentrações de EMS (200, 250, 300, e 350 mM) e DPA (25, 50, 100, 300 e 400 μM) para induzir a perda de viabilidade de culturas de P. tricornutum WT. A fluorescência da clorofila destas culturas foi medida através de dois equipamentos: leitor de microplacas e citómetro de fluxo. Após três dias de exposição aos agentes citotóxicos, as culturas foram coradas com dois corantes de fluorescência (diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína [CFDA] e SYTOX Orange) para contagem celular por citometria. A estirpe MT009 demonstrou maior resistência ao calor em temperaturas sub-letais (28 ºC) e letais (30 ºC), com as culturas a 35 ppt a manter 60% da atividade fotossintética, comparado com 10% nas culturas de 5 e 20 ppt. A maior acumulação de biomassa (1,4 g L-1), foi obtida pelas culturas MT009 a 20 e 35 ppt, a 28 ºC, nos ensaios em biorreactores. MT009 a 35 ppt teve as maiores taxas de crescimento (0,109 ± 0,011 d-1) e produtividade (0,104 ± 0,015 g L-1 d-1). Em relação às análises bioquímicas, a cultura MT009 5 ppt/ 28 ºC teve um teor proteico significativamente superior ao controlo (T4 - 33,91 ± 0,94 % DW vs. 29,09 ± 0,68 % DW; T8 - 37,93 ± 0,85 % DW vs. 31,40 ± 0,67 % DW). O conteúdo de lípidos e cinzas não apresentou diferenças significativas, mas a concentração de glícidos a 5 ppt/28 ºC (25,09 ± 0,95 % DW) foi maior que a da cultura a 35 ppt (19,95 ± 1,10 % DW). No que respeita aos pigmentos, o MT009 a 5 ppt/ 28 ºC apresentou os níveis mais baixos de clorofila a, fucoxantina e carotenóides totais, com concentrações reduzidas para metade do valor do inóculo inicial. Quanto aos ácidos gordos, verificou-se uma redução significativa dos ácidos gordos polinsaturados (PUFAs) na cultura MT009 5 ppt/ 28 ºC (38.16 ± 3.41 % of total FAME) comparado ao inóculo inicial (48.84 ± 0.08 % of total FAME). O conteúdo de EPA foi maior nas culturas a 20 ºC. A 28 ºC, a concentração de ácidos gordos saturados (SFAs) aumentou. No que diz respeito ao isolamento de mutantes termotolerantes, embora se tenham formado colónias a 30 ºC, o fenótipo termotolerante foi perdido após o primeiro subcultivo. No ensaio da viabilidade celular, verificou-se uma forte correlação entre os diferentes métodos de determinação da viabilidade das culturas, validando a fluorescência da clorofila como um indicador eficaz da viabilidade celular em culturas líquidas. Em geral, o estudo permitiu compreender fatores chave envolvidos na aquisição de termotolerância, pelas diatomáceas, e avaliar o impacto das condições de stress sobre a qualidade e valor da biomassa. Embora não tenham sido obtidos mutantes termotolerantes via mutagénese aleatória, o método é promissor, quando otimizado para a espécie. Além disso, validou-se o uso da fluorescência de clorofila, medida por espectrofotometria ou citometria, como uma técnica eficaz e prática para avaliar a viabilidade celular em culturas líquidas.	por
dc.description.abstract	Climate change poses significant challenges to microalgae cultivation, as rising temperatures complicate industrial management, leading to culture collapses and affecting biomass quality. In this sense, strain improvement, coupled with flow cytometry, has emerged as a promising tool for obtaining strains with greater resistance to heat stress. This work aimed to investigate thermotolerance induction in Phaeodactylum tricornutum, by exposing the WT strain and a previously isolated mutant (MT009) to varied salinities and temperatures, exploring salinity's impact on thermotolerance. Biochemical analyzes were conducted to assess the effects of the stress conditions on the biomass profile. Random mutagenesis combined with mutant selection through resistance to sub-lethal heat stress and diphenylamine concentrations was carried out to isolate thermotolerant strains. Moreover, the effectiveness of chlorophyll fluorescence to measure the viability of microalgae in liquid media was evaluated. The results revealed that MT009 showed greater resistance to heat, maintaining 60% of photosynthetic activity at 35 ppt at 30°C, compared to 10% at 5 and 20 ppt. MT009 cultures at 20 and 35 ppt achieved the highest biomass concentration (1.4 g L-1 ) at 28°C. MT009 at 35 ppt showed the highest growth rate (0.109 ± 0.011 d-1) and productivity (0.104 ± 0.015 g L-1 d-1) of all cultures. At 5 ppt/28°C, MT009 had a protein content of 37.93 ± 0.85% DW, higher than the control (31,40 ± 0,67 % DW). The same culture showed the lowest levels of chlorophyll a, fucoxanthin and carotenoids. Furthermore, it also exhibited a reduction in PUFAs (38.16 ± 3.41% of total FAME) and an increase in SFAs at 28°C. No novel thermotolerant mutants were obtained. Overall, the study confirmed the effect of salinity on enhancing thermotolerance in this diatom, with MT009 showing greater tolerance to thermal stress. In addition, chlorophyll fluorescence was validated as an effective indicator of cell viability.	eng
dc.description.sponsorship	This research is part of the Vertical Algae project, in particular Subproject 1c (SP1c), and is funded by the Next Generation EU European Fund and the Portuguese Recovery and Resilience Plan (PRR).
dc.identifier.tid	203876059
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.1/27049
dc.language.iso	eng
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
dc.subject	Phaeodactylum Tricornutum
dc.subject	Alterações climáticas
dc.subject	Termotolerância
dc.subject	Salinidade
dc.subject	Mutagénese aleatória
dc.subject	Citometria de fluxo
dc.title	Thermotolerance acquisition in industrial microalgal strains to sustain growth in environments under climate change	eng
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
thesis.degree.grantor	Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia
thesis.degree.level	Mestre
thesis.degree.name	Mestrado em Biotecnologia