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Isolamento e produção de agentes de controlo biológico das principais doenças de pós-colheita, em citrinos e pomóideas
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Authors
Abstract(s)
Potenciais agentes de biocontrolo foram isolados a partir da microbiota epifítica de folhas e
frutos, de citrinos e pomóideas, de diferentes pomares, durante diferentes campanhas e de
distintas condições de armazenamento.
A atividade antagonista de 1465 microrganismos isolados foi testada em ensaios in
vivo em pomóideas face a Penicillium expansum (104 esporos/ml) e em citrinos face a P.
digitatum (105 esporos/ml) em frutos feridos e inoculados artificialmente. Aproximadamente
7,6% dos isolados reduziu a severidade (diâmetro da podridão) e a incidência (% podres) em
mais de 25%, menos de 3% reduziu ambos os parâmetros em mais de 50%, mas apenas 4
microrganismos preencheram os critérios de seleção, redução da incidência e severidade em
mais de 75%. Dos 4 e pelos resultados obtidos em ensaios de seleção secundária e de
determinação da concentração mínima eficaz, destacaram-se e selecionaram-se 2
microrganismos, uma bactéria isolada de laranjas „Valencia late‟ e identificada como
pertencente ao grupo das Enterobactérias, Pantoea agglomerans PCB-1 e uma levedura
isolada a partir da superfície de maças 'Bravo de Esmolfe' identificada como Metschnikowia
andauensis PBC-2, com o objetivo de usar dois modelos distintos de agentes de biocontrol,
uma bactéria e uma levedura.
P. agglomerans é um agente de biocontrolo já conhecido. A estirpe PBC-1 isolada
neste trabalho mostrou ter elevada eficácia face aos principais agentes patogénicos na póscolheita
de citrinos e pomóideas. M. andauensis é uma levedura recentemente descoberta e a
estirpe PBC-2 diz respeito à primeira referência desta espécie como agente de biocontrolo, a
qual foi recentemente objeto de concessão de Patente de Invenção Nacional nº 105210, como
uma nova estirpe desta espécie para uso como agente de biocontrolo das doenças de póscolheita
de frutos.
A concentração mínima eficaz dos antagonistas revelou estar dentro dos limites para o
seu desenvolvimento comercial. M. andauensis PBC-2 quando aplicada à concentração de
5×106 ufc/ml, permitiu uma redução da incidência e da severidade de 62 e 70%,
respetivamente, e quando aplicada a 1×107 ufc/ml, uma redução de 90% de incidência e de
95% de severidade. P. agglomerans PBC-1 aplicada a 1 × 108 ufc/ml em maçãs e em citrinos
no controlo de P. expansum e P. digitatum, respetivamente, propiciaram uma redução
significativa de cerca de 86% de cada um dos agentes patogénicos.
O espectro de ação de M. andauensis PBC-2 foi avaliado, verificando-se o controlo efetivo
face a Rhizopus stolonifer, P. expansum e Botritys cinerea, em pera 'Rocha' e em diferentes
cultivares de maçã e contra P. digitatum e Penicillium italicum em clementinas e laranjas de
diferentes cultivares.
Durante 4 épocas, a eficácia de M. andauensis PBC-2, foi avaliada e comparada com o
fungicida sintético mais usado comercialmente, Imazalil, em ensaios semicomerciais. Os
resultados assemelharam-se aos obtidos com o fungicida, a redução da incidência do bolor
azul foi de 90% em maças armazenadas durante 3 meses a 1±0.5 ºC, seguido de 7 dias à
temperatura ambiente, para simular o tempo de prateleira.
Em ensaios do estudo da dinâmica populacional, verificou-se que o agente de
biocontrolo M. andauensis PBC-2 tem uma excelente capacidade colonizadora e que
consegue crescer e sobreviver nas feridas, mas também na superfície dos frutos, armazenados
à temperatura ambiente e em condições de frio. Pelo contrário, M. andauensis PBC- não
apresentou capacidade de sobrevivência no suco gástrico simulado, começando a população a
diminuir imediatamente após exposição e passadas 48 h não restava população viável.
Diferentes meios de cultura usualmente descritos na produção de leveduras foram
testados na produção de M. andauensis PBC-2. Aquele que apresentou a maior população
viável ao fim de 40 h de incubação foi o meio YPD, entretanto escolhido para estudos
posteriores. O pH mais favorável ao crescimento foi de 6,5, não se observando diferenças
significativas entre os crescimentos a 25 e 30 ºC. Estudou-se ainda o efeito da concentração
das duas fontes de azoto do meio YPD e elegeu-se a combinação de 10 g/l de extrato de
levedura e 20 g/l de peptona.
Nos estudos de produção de biomassa dos dois potenciais agentes de biocontrolo,
analisou-se o efeito da sacarose, frutose e glucose, como fontes de carbono e otimizou-se a
concentração destes açúcares no crescimento em Erlenmeyer. Após 20 h de incubação a
população viável de P. agglomerans PBC-1 atingiu 3.9×109, 1.5×109, 3.9×109 ufc/ml,
respetivamente. No caso de M. andauensis PBC-2, foi obtida a população de 1.2×108, 5.3×108
e 1,3×108 ufc/ml, com glucose, sacarose e frutose, após 40 h. Os resultados permitem concluir
que os dois agentes têm capacidade de metabolizar os açúcares testados, contudo e atendendo
à produtividade de biomassa, rendimento, disponibilidade e custo, optou-se por usar a
sacarose como fonte de carbono nos restantes ensaios, nomeadamente na transição de
Erlenmeyer para reator biológico. Na produção de P. agglomerans PBC-1 escolheu-se o meio
SAC (5 g/l sacarose e 5 g/l extrato de levedura). O meio YPS (12.5g/l sacarose, 10 g/l extrato
de levedura, 20 g/l peptona) foi usado no aumento de escala de M. andauensis PBC-2.
A otimização da produção em reator biológico de P. agglomerans PCB-1 foi realizada
submetendo o microrganismo a diferentes condições hidrodinâmicas, testando-se arejamentos,
dois tipos de turbina (hélice; rusthon) e dispersores (poroso, em L). Foram igualmente
estudados, o efeito da concentração inicial do inoculo e a adição programada da fonte de
carbono. Embora tenham sido testadas diferentes variações, o perfil dos diferentes parâmetros
analisados foi idêntico, a população máxima viável foi de 3-5×109 ufc/ml. A diferença mais
notória foi observada na fermentação com concentração inicial de 107 cfu/ml, que permitiu
encurtar em cinco horas a fase lag, o que pode significar uma redução de tempo de
fermentação, e consequentemente uma redução de custos.
Visando a produção de biomassa a baixo custo, fator importante na implementação de
um sistema de controlo biológico, estudou-se a possibilidade de utilizar subprodutos e
resíduos da indústria alimentar no crescimento dos agentes de biocontrolo. Subprodutos da
indústria de alfarroba e subprodutos e resíduos da indústria de sumos de citrinos foram
utilizados na produção de P. agglomerans PBC-1 e de M. andauensis PBC-2, respetivamente.
Desta forma, para além de uma redução dos custos de produção, pretendeu-se a valorização
de um subproduto (no caso de alfarroba e do bagaço de citrinos) e mitigar os efeitos nefastos
de um resíduo (licor), com elevada carga poluente, que gera graves problemas ambientais e
que pode ditar o encerramento desta unidade industrial, com efeitos devastadores para a
economia local.
Realizaram-se extrações de subprodutos da indústria de alfarroba, a diferentes razões
sólido/líquido, tempos e temperaturas, de forma a maximizar a extração de açúcares. A
potencialidade de utilizar o extrato de açúcares obtido, na produção de P. agglomerans PBC-1
foi avaliada, em ensaios de crescimento em Erlenmeyer, com consequente transição para
reator mecanicamente agitado. Os perfis de crescimento da cultura crescida com subprodutos
da indústria de alfarroba assemelharam-se aos observados com sacarose como fonte de
carbono. A biomassa viável produzida com subprodutos da indústria de alfarroba, foi de 4-
7×109 ufc/ml, o que permite concluir que é uma alternativa viável à produção deste
microrganismo.
A produção de M. andauensis PBC-2 com subprodutos da indústria de sumos de
citrinos, foi estudada em Erlenmeyer tendo como objetivo conhecer os perfis de crescimento
do microrganismo, bem como, estudar a melhor combinação desta fonte de carbono e sua
concentração. O bagaço de citrinos e um resíduo líquido, que se denominou de licor, foram
testados com resultados comparáveis à produção obtida com meio usado como standard,
(YPS), sem comprometer a atividade antagonista do agente de biocontrolo. Posteriormente,
foi realizada a produção em reator mecanicamente agitado, escolhendo-se para tal o meio YL
(10 g/l extrato de levedura e licor à concentração de açúcares de 12.5 g/l). Os parâmetros de
crescimento da cultura foram semelhantes aos obtidos com a fonte de carbono comercial.
Após aproximadamente 40 h de incubação, a população viável de M. andauensis PCB-2
atingiu 3.1×108 ufc/ml. A produtividade de biomassa e rendimento foi de 0.435 g/l.h e
1.502 g/g, respetivamente, comparável a produtividade de biomassa (0.432 g/l.h) e
rendimento (1.4416 g/g) observado no meio YPS.
Os resultados obtidos, são uma base sólida para o aumento de escala a um nível
laboratorial e semi-industrial, permitiram concluir que é exequível produzir M. andauensis a
baixo custo e representam uma possível alternativa para um resíduo.
Em estudos dos possíveis modos de ação, de M. andauensis PBC-2, conclui-se que,
este agente de biocontrolo, não tem como modos de ação a produção de antibióticos ou de
voláteis, uma vez que, não se verificou inibição do crescimento dos agentes patogénicos. A
competição por ferro e a produção de enzimas líticas por M. andauensis PBC-2 foi estudada
em meios com diferentes concentrações de ferro e em um meio de cultura, com paredes
celulares de fungos, como única fonte de carbono. Os resultados obtidos neste estudo sugerem
que a produção e secreção de enzimas líticas não é o principal ou o mais importante modo de
ação do agente de controlo biológico PBC-2, uma vez que a produção de quitinase observada
ao 5 e 7º dia de incubação foi muito baixa, e não foi observada a produção de β-1,3-
glucanases e proteases.
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Keywords
Controlo biológico Tratamento pós-colheita Citrinos Pomóideas Biomassa Reatores biológicos