Dissection of the early steps in the assembly of the 20S proteasome in Saccharomyces cerevisiae

Matias, Ana Catarina Parreira Peres

http://hdl.handle.net/10400.1/2216

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Authors

Matias, Ana Catarina Parreira Peres

Advisor(s)

Ramos, Paula

Dohmen, Jürgen

Abstract(s)

O sistema ubiquitina/proteassoma é o principal sistema de degradação proteica nas células eucariotas. Proteínas desnecessárias, que já cumpriram a sua função na célula, ou malformadas, devido a um determinado factor de stress, são encaminhadas para degradação. Primeiro são marcadas com cadeias de ubiquitina pela acção de três tipos de enzimas diferentes, E1 (enzima de activação da ubiquitina), E2 (enzima de conjugação da ubiquitina) e E3 (enzima de ligação ubiquitina-proteína). As proteínas ubiquitiladas são depois reconhecidas e degradadas pelo proteassoma 26S. A maioria dos péptidos resultantes é rapidamente degradada em aminoácidos por proteases citosólicas podendo ser depois utilizados na síntese de novas proteínas. A ubiquitina, por sua vez, é reciclada pela acção de enzimas de desubiquitilação associadas ao proteassoma 26S. Esta protease de 2000 kDa é composta pelo núcleo catalítico chamado de proteassoma 20S (CP) e pelas partículas reguladoras 19S (RP). Enquanto que o proteassoma 20S é responsável pela degradação proteica, as partículas reguladoras são responsáveis pelo reconhecimento, desenrolamento e translocação da proteína a ser degradada para o interior do proteassoma 20S. Esta partícula é composta por catorze subunidades distintas organizadas num cilindro de quatro anéis sobrepostos, contendo sete subunidades cada na disposição 1-7 1-7 1-7 1-7. As subunidades que apresentam actividade catalítica são 1, com actividade pós-acídica, 2 com actividade acídica e 5 com actividade quimiotríptica. Estes sítios activos estão localizados no interior do proteassoma 20S e portanto protegidos do meio intracelular. Apesar de ser conhecida a estrutura do proteassoma 20S em eucariotas, a forma como as 28 subunidades se associam de modo a formar uma estrutura funcional ainda não é totalmente clara. Trabalhos recentes revelaram que a montagem do proteassoma 20S é um processo ordenado que envolve vários chaperones moleculares. Estas espécies constituem um grupo diversificado de proteínas que assistem o folding e unfolding e a montagem e desmontagem de estruturas macromoleculares mas não fazem parte destas estruturas quando estão a desempenhar a sua função na célula. Em levedura, estas proteínas são Ump1 e os heterodímeros Poc1-Poc2 e Poc3-Poc4. Estes complexos apenas são funcionais quando na sua forma dimérica. Considera-se que a montagem do proteassoma é iniciada pela formação de um anel-composto por sete subunidades diferentes com a ajuda dos chaperones Poc1- Poc2 e Poc3-Poc4. Esta estrutura serve como plataforma para a incorporação do chaperone molecular Ump1 e das subunidades . A primeira a ser incorporada é a subunidade 2, seguida pelas subunidades 3 e 4. Nesta etapa, o heterodímero Poc3-Poc4 abandona a montagem e as subunidades 5, 6 e 1 são incorporadas, formando-se assim uma metade proteassomal ou complexo 15S. A junção das duas metades é promovida pela incorporação de 7. A dimerização promove a maturação do proteassoma 20S tornando-se este activo. Como consequência Ump1 e Poc1-Poc2 convertem-se nos primeiros substratos do proteassoma. É principalmente, sobre os passos iniciais desta via de montagem que é maior a falta de informação e, portanto, o objectivo deste trabalho é tentar identificar complexos que se formam durante estes passos iniciais utilizando como modelo biológico a levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae. Para tal, as subunidades α e β, para além dos chaperones mencionados, foram marcadas com um determinado epítopo no seu C-terminal a fim de poderem ser detectadas por immunoblotting. De modo a analisar o conteúdo proteico resultante das diferentes manipulações genéticas, várias técnicas bioquímicas foram utilizadas como a análise de proteínas por SDS-PAGE, gel nativo e a separação de complexos proteicos por cromatografia de filtração em gel. Nesta técnica as proteínas são separadas de acordo com a sua massa molecular em que os complexos maiores são eluídos primeiro e por último os complexos mais pequenos. Foram utilizadas duas colunas diferentes de acordo com o tamanho dos complexos a serem separados. A coluna Superdex-200 apresenta uma resolução máxima para complexos entre 10 e 600 kDa enquanto que a coluna Superose-6 entre 5 e 5000 kDa. Os chaperones moleculares que assistem a montagem do proteassoma 20S em levedura estão presentes em diferentes complexos intermediários. O chaperone Ump1 parece existir apenas nos complexos 15S, enquanto que Poc2 foi detectado não só neste último complexo como também em complexos de maior massa molecular, como o proteassoma 20S. As subunidades β parecem estar presentes em complexos de maior massa molecular, como o proteassoma 26, 20 e 15S enquanto que a subunidades não só estão presentes nestes complexos como também em complexos precursores, sugerindo que as subunidades  poderão ser as primeiras subunidades a incorporar em complexos precursores. De acordo com o nosso trabalho apenas as subunidades 1, 2 e 4 parecem existir em complexos precursores sugerindo a sua existência em complexos iniciais. Contudo, os complexos precursores contendo a subunidade 4 mereceram a maior atenção neste trabalho. Para entender um pouco melhor os complexos 4, o conteúdo proteico das fracções de filtração em gel foi analisado num gel nativo tendo sido identificados dois complexos precursores compostos pela subunidade 4 que parecem seguir uma ordem de montagem. Neste trabalho, várias experiências foram desenhadas a fim de caracterizar estes complexos precursores, denominados apenas por complexos 4. Ao sobrexpressar 4 em levedura observou-se uma acumulação de complexos 4, curiosamente sem provocar um aumento na quantidade de proteassomas 26 e 20S. Em bactéria, a sobrexpressão de 4 revelou uma acumulação de complexos contendo 4 nas fracções onde tipicamente são eluídos os complexos 4 em levedura na coluna Superdex200 (fracções 24, 25 e 26). Estas observações sugerem que 4 tem tendência a formar oligómeros. A marcação da subunidade 4 com o epítopo GFP no seu C-terminal teve como objectivo provocar um aumento significativo (cerca de 30 kDa) na sua massa molecular. Quer por filtração em gel, quer por gel nativo, os típicos complexos 4, normalmente detectados por volta dos 150 kDa, desapareceram para originar complexos de maior massa molecular, sugerindo que os complexos 4 poderão ser constituídos por mais do que uma subunidade 4. A purificação dos complexos 4 envolveu a marcação da referida subunidade com epítopo FLAG no seu C-terminal. Num primeiro passo todos os complexos contendo 4 foram purificados utilizando uma resina anti-FLAG. Num segundo passo os complexos 4 foram separados dos outros complexos proteassomais por cromatografia de filtração em gel. O material eluído nas fracções 25 e 26 foi concentrado, analisado por SDS-PAGE, corado com prata e analisado por espectrometria de massa. A subunidade 4 foi identificada, como esperado, bem como os chaperones moleculares Ssa2 e Sse2 e outras proteínas aparentemente não relacionadas com o proteassoma (RNAse, Cdc25, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, isopropil malato desidrogenase). Devido às suas propriedades de chaperones moleculares, Ssa2 e Sse2 foram considerados candidatos a participarem na montagem do proteassoma. A família de chaperones Hsp70, do inglês heat shock proteins of 70 kDa, é a mais abundante e melhor estudada. Assistem uma vasta gama de processos celulares como a montagem de complexos proteicos tanto em condições de stress como em condições normais. O seu mecanismo de acção consiste num ciclo de ligação/libertação da proteína-substrato conduzido pela mudança entre um estado de baixa afinidade para o ATP e um estado de elevada afinidade para o ADP. Este ciclo é controlado tanto por co-chaperones da família Hsp40 (Ydj1), que dirigem os Hsp70 para os seus substratos, como por factores permutadores de nucleótidos que determinam o tempo de vida do complexo Hsp70-substrato. Estes factores permutadores são chamados de NEF, do inglês Nucleotide Exchange Factor. Os chaperones moleculares da família Hsp110 foram recentemente descritos como factores permutadores de Hsp70. Estas duas famílias de chaperones são estruturalmente muito semelhantes entre si mas ao contrário de Hsp70, Hsp110 não parece estar envolvida no folding proteico. Parece sim actuar como holdases, de modo a manter a solubilidade das proteínas desnaturadas. Em levedura, as proteínas Ssa1 (stress-seventy subfamily A), Ssa2, Ssa3 e Ssa4 são membros da família Hsp70 enquanto que Sse1 (stress-seventy subfamily E) e Sse2 representam a família Hsp110. Estas duas famílias de chaperones moleculares são essenciais para a viabilidade celular demonstrando o seu importante papel na célula. Métodos bioquímicos e genéticos foram usados para demonstrar que os chaperones Hsp110 e Hsp70 são novos factores que promovem a montagem do proteassoma 20S. Porque a delecção conjunta dos membros de cada família de chaperones é inviável, os complexos 4 foram analisados individualmente nos mutantes sse1Δ, sse2Δ e ssa1-ts (ssa1ts ssa2Δ ssa3Δ ssa4Δ) para avaliar o efeito da inexistência desses genes na montagem do proteassoma. Apesar da análise dos complexos 4 por filtração em gel não mostrar diferenças significativas nos mutantes analisados, a sua análise num gel nativo revelou ser mais evidente. Sse2 não parece afectar a formação dos complexos 4 ao contrário de Sse1 e Hsp70. Nos mutantes sse1Δ e ssa1-ts para além de não detectarmos o complexo 4 de menor mobilidade electroforética num gel nativo, foi detectado a existência de um novo complexo 4, denominado i de intermediário. Curiosamente, o complexo 4 de maior mobilidade electroforética, chamado de complexo 4 0, não parece ser afectado pela ausência destes chaperones. Os chaperones Sse1 e Ssa1 existem num complexo com aparentemente a mesma mobilidade que o complexo 4 de menor mobilidade electroforética num gel nativo. Face a estas observações, Sse1 e Ssa1 parecem estar presentes neste complexo juntamente com 4 sendo este denominado de c para indicar o complexo com chaperones. O mutante ssa1-ts possui os genes SSA2, SSA3 e SSA4 deletados e uma mutação sensível à temperatura no gene SSA1. Esta última mutação faz com que a estirpe seja viável pois alguma proteína Ssa1 funcional é expressa, o que seria de esperar a formação de complexo 4 c. No entanto, sabese que esta proteína mutante consegue interagir com Sse1 mas estes complexos possuem diferentes características quando comparados com o complexos wild-type Sse1-Ssa1. Estas diferenças poderão explicar a inabilidade da proteína mutante Ssa1-ts em promover a formação de complexo 4 c. Continuando a busca por evidências que suportem a existência de Sse1 e Hsp70 no complexo 4 c, foi analisado o efeito da adição de nucleótidos, ATP ou ADP, sabendo que estes promovem a associação de Sse1 a Ssa1. A adição de nucleótidos promove a formação de complexo 4 c portanto suportando a ideia da existência de Sse1 e Hsp70 no complexo 4 c. Curiosamente, a adição da proteína Sse1 ao extracto proteico de sse1Δ, promoveu a formação do complexo 4 c com o concomitante desaparecimento do complexo 4 i, apoiando a ideia da existência de Sse1 no complexo 4 c. Os mutantes sse1Δ e ssa1-ts revelaram dificuldades no crescimento a 30 ºC e sensibilidade a elevadas temperaturas (37 ºC), que é um efeito esperado devido às suas características de proteínas de choque térmico. O mutante sse1Δ demostrou alguma resistência à droga 4NQO, característica esta típica de mutantes que afectam a biogénese do proteassoma. Contudo, esta observação não se verificou para o mutante ssa1-ts. Na tentativa de obter efeitos mais acentuados, sse1Δ foi combinado com mutantes que por si só apresentam defeitos na montagem do proteassoma, ump1Δ, 3Δ, poc1Δ ou poc3Δ. Os duplos mutantes 3Δ sse1Δ, poc3Δ sse1Δ e ump1Δ sse1Δ exibiram dificuldades acrescidas no crescimento a 30 ºC, sugerindo que a delecção do gene SSE1 acentuou as dificuldades na montagem do proteassoma dos mutantes individuais. Por outro lado, esta observação não foi verificada para poc1Δ sse1Δ. Esta diferença está de acordo com a ideia de que Poc1 e Poc3 estão envolvidos em diferentes passos na montagem do proteassoma. Como 3, Ump1 e Poc3 estão envolvidos na montagem do proteassoma, estas observações sugerem um papel para Sse1 na biogénese do proteassoma. Apesar dos efeitos verificados ao nível do crescimento celular, os duplos mutantes não revelaram efeitos extra ao nível dos complexos 4. A sobrexpressão de Sse1 nas células de levedura não teve qualquer impacto no crescimento celular mas revelou diferenças ao nível dos complexos 4. Para além do desaparecimento do complexo 4 c, foi identificado um novo complexo precursor de menor mobilidade electroforética, o que apoia a existência de um papel na montagem do proteassoma para Sse1. A subunidade 3 é a única subunidade proteassomal não essencial, sendo as restantes necessárias para a viabilidade celular. Em alternativa à delecção de genes, a expressão dos genes que codificam para algumas subunidades proteassomais essenciais foram regulados recorrendo-se à substituição dos seus promotores nativos por outros reguláveis, o promotor GALS. Na presença de galactose no meio de crescimento, a subunidade regulada é sobrexpressa mas na presença de glucose esta expressão é reduzida, fazendo com que a expressão da subunidade alvo seja shut-down ou “desligada”. Assim foi possível parar a formação do proteassoma no passo imediatamente antes da incorporação da subunidade sob o controlo do promotor GALS, e analisar os vários complexos intermediários que existiam na célula na ausência da subunidade em estudo. O shut-down das subunidades 1, 2, 4 e 6 têm efeitos distintos na montagem do proteassoma, visto que foi observada a acumulação de diferentes complexos precursores. Curiosamente, o shut-down da subunidade 2 demonstrou a acumulação de um complexo precursor aparentemente constituído apenas pela subunidade 4 visto que nenhuma outra subunidade foi identificada num complexo com a mesma mobilidade electroforética. Esta observação sugere que os complexos 4 não conseguem prosseguir uma via normal de montagem sem a presença de 2. Reunindo os resultados obtidos neste estudo, foi proposto um modelo para a formação do anel-. Neste modelo a montagem do proteassoma começaria com a formação de um complexo formado por várias subunidades 4 que corresponderia ao complexo 4 0. Com a ajuda de Sse1 e Hsp70, este complexo seria convertido noutro complexo precursor chamado de complexo 4 c. Na ausência de Sse1, o complexo 4 c não se poderia formar, formando-se antes um complexo intermediário i. Como perspectiva futura seria interessante descobrir qual a função de Sse1 e Hsp70 na montagem do proteassoma e qual a constituição dos complexos 4 0, i e c. Ainda existem muitas questões em aberto mas os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para compreender melhor a montagem do proteassoma. Observou-se que as subunidades parecem ser as primeiras subunidades a serem incorporadas na montagem do proteassoma e depois as subunidades β. De todas as subunidades , apenas 1, 2 e 4 parecem ser responsáveis pela formação dos complexos iniciais. Foi identificado um complexo precursor constituído por 4, Sse1 e Hsp70 o que confere uma nova função à família de chaperones moleculares Hsp70 e Hsp110, o envolvimento na biogénese do proteassoma. Com a compreensão dos detalhes da via de montagem do proteassoma 20S poder-se-á estudar o efeito de fármacos que regulem a síntese do proteassoma, e que se tornarão relevantes no tratamento de anomalias patológicas onde o proteassoma se encontra envolvido, como por exemplo o cancro ou doenças neurodegenerativas.