Sistemas bacterianos com expressão do complexo enzimático de citocromos P450 humanos

Lourenço, Carmen Luísa Silva

http://hdl.handle.net/10400.1/1679

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Authors

Lourenço, Carmen Luísa Silva

Advisor(s)

Kranendonk, Michel

Abstract(s)

A NADPH oxidoreductase dos citocromos P450 (CYPOR) codificada pelo gene POR é uma flavoproteína, localizada no retículo endoplasmático, cuja principal função é a transferência de electrões para todos os citocromos P450 microssomais e várias enzimas oxigenases. Mutações no gene POR têm sido relacionadas com uma doença genética autossómica recessiva, a Síndroma de Antley Bixler (ABS), entre os quais o mutante CYPOR Q153R. Contudo existem resultados contraditórios no que concerne ao efeito desta mutação na actividade de CYPOR. Numa primeira fase deste projecto pretendeu-se avaliar o efeito da mutação Q153R de CYPOR na biotransformação de xenobióticos mediada pelo CYP1A2. Numa segunda fase do trabalho, pretendeu-se desenvolver uma metodologia eficaz que permitisse dosear CYPOR em bactérias intactas. O trabalho foi iniciado com o desenvolvimento das estirpes BTC1A2-POR expressando heterologamente as proteínas recombinantes humanas CYP1A2 e CYPOR, tendo sido construídas três estirpes: BTC1A2-PORnull, BTC1A2-PORwt e BTC1A2- PORQ153R. O efeito do mutante Q153R de CYPOR, na sustentação da actividade do CYP1A2 foi avaliado através de ensaios de mutagenicidade com 2-aminoantraceno (2AA), 2-amino-3-metilimidazol (4,5-f)quinolina (IQ) e 4-(metilnitrosamina)-1-(3- piridil)-1-butanona (NNK). Foram também efectuados ensaios de cinética com etoxiresorufina (EROD), metoxiresorufina (MROD) e 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC). O mutante Q153R demonstrou actividade igual à proteína selvagem em todos os ensaios efectuados. Na segunda fase do trabalho, para dosear CYPOR em células inteiras foi necessário diferenciar a actividade de CYPOR da actividade das reductases de E.coli K12. Para tal realizaram-se ensaios de redução com vários substratos e tentou-se optimizar as condições de ensaio, primeiramente em membranas e posteriormente em bactérias intactas. Os resultados obtidos não foram conclusivos mas podem conduzir a novas abordagens para o desenvolvimento de uma metodologia que permita o doseamento de CYPOR em bactérias intactas.