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Publication
Characterization of 5´ and 3´ UTRs from Bone morphogenetic protein receptor type 1A (Bmpr1A) transcripts under the context of bone metabolism
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.92 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
During our life our bones are in a constant balance between bone formation by osteoblasts and
bone resorption by osteoclasts. Bone morphogenetic proteins are a group of cytokines from the
transforming growth factor-β family involved in several processes. Their signal is transduced
through two types of serine/threonine kinase receptors, BMPRI and BMPRII. BMPRIA is a type
one receptor involved in osteoblast/osteoclast communication and therefore affecting bone
metabolism. Upon binding of different ligands, type II phosphorylates the type I and activates one
of the signal pathways. Although their function is known, the mechanisms of regulation of
expression are still unclear.
The objective of this work was to characterize some of the Mus musculus Bmpr1a molecular
regulatory mechanisms including upstream open reading frames (uORFs), polyadenylation sites,
microRNA binding sites and constitutive decay elements (CDE).
Bioinformatically, we were able to identify 11 Mus musculus Bmpr1a transcripts on available
databases, 11 polyadenylations and a constitutive decay element on the 3’UTR, while on 5’UTR
we were able to identify 3 uORFs. Experimentally, we isolated a new and shorter Bmpr1a 3’UTR
with an alternative polyadenylation site from MC3T3-E1 but without the CDE We tried to isolate
different fragments from different tissues, but we were capable of isolate a longer transcript only
from mouse liver that contains the CDE loop. Within the 5’UTRs we isolated 4 different fragments
containing 2 or 3 uORFs and insert them on reporter plasmids for functional analysis. The last step
was mutating all the AUG from uORFs and validating their effect on regulation of luciferase
expression. We measured a decrease in the expression of luciferase on fragments containing no
mutations and an increase in the expression of fragments with mutations, except in one case where
the mutation was inserted 7bp after the start of the fragment. Results indicate that there were no
different transcripts from proliferating and differentiated cells, and in the 5’ UTR , the uORFs could
possibly contribute to regulate the expression of Bmpr1a. However further studies are needed to
confirm and expand our data.
As Bone morphogenetic proteins (BMP) são um grupo de citocinas pertencentes à família de proteínas do Transforming growth factor β e estão envolvidas em vários processos celulares importantes como o regulamento da divisão celular e de diferenciação de células. Estas proteínas transmitem o sinal para dentro das células através de dois tipos de recetores de serina/treonina diferentes, os Bone morphogenetic proteins receptors (BMPR) tipo I e tipo II. Estes recetores formam homo e hétero dímeros entre si para formar um recetor totalmente funcional; quando isso acontece e após a ligação de uma molécula aos receptores, o tipo II fosforila o tipo I levando a uma cascata de fosforilação no interior da célula podendo ativar diferentes vias se sinalização dependendo da molécula que se liga ao recetor e qual os dímeros de recetores que se formaram. Alguns dos exemplos de vias de sinalização que se ativam aquando da ligação de moléculas a estes recetores são as vias Smad, MAPK, PI3K/Akt, Wnt ou ERK1/2 que são importantes reguladores da expressão de genes e que atuam em processos celulares importantes como diferenciação celular e formação de tecidos. As BMPRs estão envolvidas também nos processos de metabolismo do osso associados à deposição de hidroxiapatite pelos osteoblastos e reabsorção óssea pelos osteoclastos que degradam a matriz extracelular. Apesar de se conhecer a função da BMPR1A, nem todos os mecanismos de regulação pós-transcrição da sua expressão estão estudados. O objetivo deste trabalho é contribuir para a caracterização dos mecanismos de regulação dos diferentes transcritos de Bmpr1a, e determinar quais os elementos regulatórios pós-transcrição presentes nas sequências identificadas, tanto na região 5’ untraslated region (UTR), como na região 3’UTR. Começou-se por identificar os diferentes transcritos de bmpr1a sendo possível identificar 11 diferentes transcritos de Bmpr1a de mus musculus (ratinho) e 5 diferentes transcritos de BMPR1A de homo sapiens (humano) em diferentes bases de dados. Procurou-se também identificar sequencias associadas a locais de poliadenilação sendo que no ratinho foi possível encontrar 11 diferentes locais de poliadenilação, dos quais 6 contêm a sequencia canónica de poliadenilação, enquanto os outros 5 foram obtidos através do uso de ferramentas bioinformáticas como o RegRNA2.0. Nos transcritos de homo sapiens identificou se 8 locais de poliadenilação. De seguida identificou se a presença de um loop de degradação constitutivo (Constitutive Decay Element - CDE). Este loop está presente em 8 das 11 sequencias de ratinho identificadas enquanto no humano está presente em todos os transcritos. Verificou-se igualmente a conservação deste loop em 24 espécies diferentes e foi possível verificar que se encontra totalmente conservado em 18 dessas 24 espécies e em 22 delas contem a sequencia necessária para que seja funcional. Outro dos elementos regulatórios que se identificou foram locais ricos em Adeninas/Uracilos que são associados a um aumento de afinidade de ligação de proteínas reguladoras. Foi possível identificar a sequencia mínima para a ligação dessas proteínas, mas não foi possível encontrar um dos 5 diferentes conjuntos de sequências que estão descritas na literatura. Por último construiu-se uma árvore filogenética da região 3’UTR dos transcritos de Bmpr1a para perceber as relações filogenéticas desta região não codificante entre diferentes espécies de vertebrados. Na região 5’ identificou-se a presença de upstream Open Reading frames (uORFs) tendo sido verificada a presença de 3 uORFs conservadas na maior parte dos transcritos analisados e conservados em várias espécies de mamíferos exceto nos marsupiais. Experimentalmente, foi possível isolar um transcrito da região 3’UTR de Bmpr1a de ratinho com 250 pares de bases tanto em células em proliferação como em células diferenciadas em osteoblastos. Este transcrito contém um local de poliadenilação alternativo antes da cauda de poliadeninas e não contém o loop de degradação constitutivo. Foi-se então tentar isolar transcritos de outros tecidos de ratinho. Começou se por tentar isolar transcritos de Bmpr1a em tecidos de joelho e de articulações não sendo possível isolar transcritos de outros tamanhos além do transcrito de 250 pares de bases acima indicado. No entanto foi possível identificar a partir de fígado um transcrito com 1500 pares de base o qual já contem o loop de degradação constitutivo. Na região 5’ isolamos 4 fragmentos diferentes contendo 2 ou 3 das uORFs e com diferentes distâncias entre estas e o início dos fragmentos. Esses 4 fragmentos foram de seguida inseridos com a orientação correta num vetor de expressão para a luciferase e transfectados em células Hek293 (do inglês Human Embrionic Kidney) e os valores de luminescência registados. Observou-se nos resultados preliminares uma diminuição da expressão da luciferase associada à presença das uORFs dos transcritos sem mutações. Apos a mutação dos AUGs para AAG por SDM verificou-se que no fragmento mais longo (fragmento A) parece haver uma tendência para o aumento da luciferase ao longo das mutações sequenciais dos AUG, confirmado pelas mutações individuais. No segundo fragmento (fragmento B) analisado ocorre um aumento da expressão da luciferase quando se mutou o AUG da uORF1 em comparação com o controlo, contudo na mutação da uORF2 ocorre uma diminuição dramática da expressão da luciferase que é confirmada pela mutação isolada da uORF. Uma das possíveis explicações para esta diminuição da expressão da luciferase é a localização desta uORF no fragmento, pois esta uORF está localizada no início do fragmento, a 7 pares de base do início da mesma, podendo levar a uma destabilização deste fragmento e consequentemente levando ao resultado observado, ou seja, à diminuição da expressão da luciferase. No último fragmento (fragmento D) que não contem a uORF2 é possível observar uma diminuição da expressão da luciferase no fragmento sem nenhuma mutação dos AUG, enquanto um aumento da expressão da luciferase nos fragmentos que contem as mutações sequenciais. Sendo que apenas duas experiências foram efetuadas com este fragmento, mais estudos são necessários para determinar se a ausência da uORF2 tem algum efeito na regulação da expressão deste fragmento Podemos então com este trabalho concluir que na região 3’UTR se encontra um loop de degradação constitutivo que está bastante conservado, podendo assim significar que aquela região pode ser importante para a regulação da expressão do gene. Contudo experimentalmente não foi possível isolar das células MC3T3-E1 um fragmento dessa região, podendo ser devido à necessidade destas células de ratinho expressarem esta proteína que está envolvida na comunicação entre osteoblastos e osteoclastos. Experimentalmente podemos também verificar que existem na região 5’UTR do Bmpr1a 3 uORFs que podem, portanto, vir a ter efeito na regulação da expressão do gene, mas mais estudos precisam de ser feitos para confirmar ou não esta atividade.
As Bone morphogenetic proteins (BMP) são um grupo de citocinas pertencentes à família de proteínas do Transforming growth factor β e estão envolvidas em vários processos celulares importantes como o regulamento da divisão celular e de diferenciação de células. Estas proteínas transmitem o sinal para dentro das células através de dois tipos de recetores de serina/treonina diferentes, os Bone morphogenetic proteins receptors (BMPR) tipo I e tipo II. Estes recetores formam homo e hétero dímeros entre si para formar um recetor totalmente funcional; quando isso acontece e após a ligação de uma molécula aos receptores, o tipo II fosforila o tipo I levando a uma cascata de fosforilação no interior da célula podendo ativar diferentes vias se sinalização dependendo da molécula que se liga ao recetor e qual os dímeros de recetores que se formaram. Alguns dos exemplos de vias de sinalização que se ativam aquando da ligação de moléculas a estes recetores são as vias Smad, MAPK, PI3K/Akt, Wnt ou ERK1/2 que são importantes reguladores da expressão de genes e que atuam em processos celulares importantes como diferenciação celular e formação de tecidos. As BMPRs estão envolvidas também nos processos de metabolismo do osso associados à deposição de hidroxiapatite pelos osteoblastos e reabsorção óssea pelos osteoclastos que degradam a matriz extracelular. Apesar de se conhecer a função da BMPR1A, nem todos os mecanismos de regulação pós-transcrição da sua expressão estão estudados. O objetivo deste trabalho é contribuir para a caracterização dos mecanismos de regulação dos diferentes transcritos de Bmpr1a, e determinar quais os elementos regulatórios pós-transcrição presentes nas sequências identificadas, tanto na região 5’ untraslated region (UTR), como na região 3’UTR. Começou-se por identificar os diferentes transcritos de bmpr1a sendo possível identificar 11 diferentes transcritos de Bmpr1a de mus musculus (ratinho) e 5 diferentes transcritos de BMPR1A de homo sapiens (humano) em diferentes bases de dados. Procurou-se também identificar sequencias associadas a locais de poliadenilação sendo que no ratinho foi possível encontrar 11 diferentes locais de poliadenilação, dos quais 6 contêm a sequencia canónica de poliadenilação, enquanto os outros 5 foram obtidos através do uso de ferramentas bioinformáticas como o RegRNA2.0. Nos transcritos de homo sapiens identificou se 8 locais de poliadenilação. De seguida identificou se a presença de um loop de degradação constitutivo (Constitutive Decay Element - CDE). Este loop está presente em 8 das 11 sequencias de ratinho identificadas enquanto no humano está presente em todos os transcritos. Verificou-se igualmente a conservação deste loop em 24 espécies diferentes e foi possível verificar que se encontra totalmente conservado em 18 dessas 24 espécies e em 22 delas contem a sequencia necessária para que seja funcional. Outro dos elementos regulatórios que se identificou foram locais ricos em Adeninas/Uracilos que são associados a um aumento de afinidade de ligação de proteínas reguladoras. Foi possível identificar a sequencia mínima para a ligação dessas proteínas, mas não foi possível encontrar um dos 5 diferentes conjuntos de sequências que estão descritas na literatura. Por último construiu-se uma árvore filogenética da região 3’UTR dos transcritos de Bmpr1a para perceber as relações filogenéticas desta região não codificante entre diferentes espécies de vertebrados. Na região 5’ identificou-se a presença de upstream Open Reading frames (uORFs) tendo sido verificada a presença de 3 uORFs conservadas na maior parte dos transcritos analisados e conservados em várias espécies de mamíferos exceto nos marsupiais. Experimentalmente, foi possível isolar um transcrito da região 3’UTR de Bmpr1a de ratinho com 250 pares de bases tanto em células em proliferação como em células diferenciadas em osteoblastos. Este transcrito contém um local de poliadenilação alternativo antes da cauda de poliadeninas e não contém o loop de degradação constitutivo. Foi-se então tentar isolar transcritos de outros tecidos de ratinho. Começou se por tentar isolar transcritos de Bmpr1a em tecidos de joelho e de articulações não sendo possível isolar transcritos de outros tamanhos além do transcrito de 250 pares de bases acima indicado. No entanto foi possível identificar a partir de fígado um transcrito com 1500 pares de base o qual já contem o loop de degradação constitutivo. Na região 5’ isolamos 4 fragmentos diferentes contendo 2 ou 3 das uORFs e com diferentes distâncias entre estas e o início dos fragmentos. Esses 4 fragmentos foram de seguida inseridos com a orientação correta num vetor de expressão para a luciferase e transfectados em células Hek293 (do inglês Human Embrionic Kidney) e os valores de luminescência registados. Observou-se nos resultados preliminares uma diminuição da expressão da luciferase associada à presença das uORFs dos transcritos sem mutações. Apos a mutação dos AUGs para AAG por SDM verificou-se que no fragmento mais longo (fragmento A) parece haver uma tendência para o aumento da luciferase ao longo das mutações sequenciais dos AUG, confirmado pelas mutações individuais. No segundo fragmento (fragmento B) analisado ocorre um aumento da expressão da luciferase quando se mutou o AUG da uORF1 em comparação com o controlo, contudo na mutação da uORF2 ocorre uma diminuição dramática da expressão da luciferase que é confirmada pela mutação isolada da uORF. Uma das possíveis explicações para esta diminuição da expressão da luciferase é a localização desta uORF no fragmento, pois esta uORF está localizada no início do fragmento, a 7 pares de base do início da mesma, podendo levar a uma destabilização deste fragmento e consequentemente levando ao resultado observado, ou seja, à diminuição da expressão da luciferase. No último fragmento (fragmento D) que não contem a uORF2 é possível observar uma diminuição da expressão da luciferase no fragmento sem nenhuma mutação dos AUG, enquanto um aumento da expressão da luciferase nos fragmentos que contem as mutações sequenciais. Sendo que apenas duas experiências foram efetuadas com este fragmento, mais estudos são necessários para determinar se a ausência da uORF2 tem algum efeito na regulação da expressão deste fragmento Podemos então com este trabalho concluir que na região 3’UTR se encontra um loop de degradação constitutivo que está bastante conservado, podendo assim significar que aquela região pode ser importante para a regulação da expressão do gene. Contudo experimentalmente não foi possível isolar das células MC3T3-E1 um fragmento dessa região, podendo ser devido à necessidade destas células de ratinho expressarem esta proteína que está envolvida na comunicação entre osteoblastos e osteoclastos. Experimentalmente podemos também verificar que existem na região 5’UTR do Bmpr1a 3 uORFs que podem, portanto, vir a ter efeito na regulação da expressão do gene, mas mais estudos precisam de ser feitos para confirmar ou não esta atividade.
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Keywords
Bone BMP BMPR1a uORFs CDE