Publicação
Development of IL-11 receptor targeting miniproteins
| datacite.subject.fos | Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias | |
| datacite.subject.sdg | 03:Saúde de Qualidade | |
| datacite.subject.sdg | 09:Indústria, Inovação e Infraestruturas | |
| datacite.subject.sdg | 17:Parcerias para a Implementação dos Objetivos | |
| dc.contributor.advisor | Oroszlan, Gabor | |
| dc.contributor.advisor | Power, Deborah Mary | |
| dc.contributor.author | Komporday, Katalin Luca | |
| dc.date.accessioned | 2026-06-05T17:54:22Z | |
| dc.date.available | 2026-06-05T17:54:22Z | |
| dc.date.issued | 2025-11-25 | |
| dc.description.abstract | De novo protein design has emerged as a transformative approach for creating novel therapeutic molecules with highly specific functions and tailored structures. This thesis presents the design and development of miniproteins targeting the interleukin-11 receptor alpha (IL-11Rα), a key mediator in fibrotic diseases such as idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). Miniproteins, small stable peptides with well-defined tertiary structures, offer advantages over traditional therapies by small molecules or antibodies through higher selectivity, improved tissue penetration, and lower risk of immunogenicity. Leveraging AI-driven bioinformatics tools, a library of 400 different miniprotein scaffolds was designed to selectively bind the IL-11Rα, competing with its natural ligand, IL-11 cytokine. The miniprotein library was synthesized as an oligonucleotide pool, cloned into phagemid vectors, and expressed on the pIII M13 bacteriophage surface for phage display-based selection. A biopanning campaign was used to enrich miniproteins with strong binding affinities for IL-11Rα across multiple screening rounds. Two lead candidates, DN226 and DN213 demonstrated high specificity and affinity confirmed by ELISA assays. However, DN226 showed a better affinity and competitiveness against the IL-11 cytokine for binding to the receptor compared to DN213. Since transient transfection expression of IL-11Rα in FreeStyle Human Embryonic Kidney (HEK293-F) cells faced yield and aggregation challenges, commercially sourced IL-11Rα was employed in downstream assays. The combination of computational design with classical biotechnological approaches enabled the rapid identification of functional miniproteins capable of binding the IL-11Rα. This work underscores the potential of AI-driven de novo protein design as a versatile technology for precise drug discovery and development. The identified miniproteins provide promising hit molecules for developing innovative, targeted anti-fibrotic therapies. Future work should focus on optimizing miniprotein candidates and evaluating their efficacy in cell-based and in vivo studies, paving the way for novel treatment approaches for fibrotic diseases, like IPF. | eng |
| dc.description.abstract | O design de proteínas de novo surgiu como uma das fronteiras mais poderosas da biotecnologia moderna, permitindo a criação de biomoléculas completamente novas com estruturas e funções biológicas altamente específicas. Esta abordagem transformacional é especialmente atraente para doenças nas quais as terapias convencionais, como anticorpos monoclonais ou pequenas moléculas, têm demonstrado baixa eficácia ou pouca acessibilidade aos tecidos. As doenças fibróticas, incluindo a fibrose pulmonar idiopática (FPI), representam uma área de grande necessidade médica, na qual estratégias moleculares inovadoras são urgentemente necessárias. Na última década, a citocina interleucina-11 (IL-11) ganhou reconhecimento como um fator central da fibrose em vários órgãos. A IL-11 promove a ativação de fibroblastos, a transformação em miofibroblastos, a deposição excessiva de colagénio e a remodelação desregulada dos tecidos, principalmente através de vias dependentes de ERK. O alvo do eixo IL-11/receptor alfa da IL-11 (IL-11Rα) surgiu, portanto, como uma estratégia terapêutica promissora, oferecendo a perspectiva de interromper ou mesmo reverter os processos fibrogénicos na sua origem molecular. A FPI é caracterizada por cicatrizes crónicas e progressivas do parênquima pulmonar, com perda de elasticidade pulmonar, comprometimento da troca gasosa, falta de ar e, por fim, insuficiência respiratória. Apesar dos avanços significativos na compreensão da sua fisiopatologia, a FPI continua a ser uma doença fatal, com uma sobrevivência média de apenas 2 a 3 anos após o diagnóstico. A pirfenidona e o nintedanibe são medicamentos antifibróticos atualmente aprovados que podem retardar a progressão da doença, mas não revertem a fibrose estabelecida; ambos estão associados a efeitos adversos substanciais. Portanto, o desenvolvimento de terapêuticas que intervenham a montante na cascata fibrogênica é fundamental para melhorar os resultados dos pacientes.Neste contexto, as miniproteínas representam uma nova classe de moléculas especialmente adequadas para atingir interações proteína-proteína extracelulares. Concebidas para variar entre 1 e 10 kDa, as miniproteínas têm arquiteturas compactas estabilizadas por núcleos hidrofóbicos, elementos de estrutura secundária e comportamento de dobragem cooperativa. O seu tamanho reduzido permite uma penetração nos tecidos superior em comparação com os anticorpos, enquanto as superfícies concebidas computacionalmente permitem uma ligação de alta afinidade e alta especificidade a alvos terapêuticos. Esses avanços são agora aprimorados pela rápida geração de diversas estruturas de miniproteínas com precisão atómica por meio de plataformas de previsão estrutural baseadas em aprendizado de máquina, como RFdiffusion, ProteinMPNN e AlphaFold2. Essas ferramentas, por sua vez, combinadas com métodos de seleção empíricos, estabelecem uma estrutura sólida para a descoberta de novas terapias que atuam contra alvos moleculares desafiadores, como o IL-11Rα. Com base nesses avanços, este trabalho concentrou-se no design de novo de miniproteínas que se ligam ao IL-11Rα e inibem competitivamente a sua interação com o IL-11. Um total de 400 miniproteínas estruturalmente diversas foram projetadas computacionalmente usando pipelines assistidos por IA otimizados tanto para complementaridade de forma quanto para afinidade de ligação prevista. As sequências projetadas foram sintetizadas como um conjunto de oligonucleotídeos e clonadas no fagémido pAS62 para exibição monovalente na proteína pIII do bacteriófago M13. Esse formato permitiu a triagem simultânea de centenas de candidatos por meio de uma campanha iterativa de seleção de exibição de fagos. Abordagens paralelas incluíram a expressão de IL-11Rα recombinante em células FreeStyle HEK293-F de mamíferos para permitir a produção de um recetor biologicamente relevante para ensaios de ligação. A expressão e purificação de IL-11Rα interna foram dificultadas devido aos baixos rendimentos e à agregação de proteínas durante o processamento a jusante. Para garantir condições de seleção confiáveis e reproduzíveis, o IL-11Rα obtido comercialmente foi usado nas etapas subsequentes de triagem e validação. A biopanning com exibição de fagos foi realizada utilizando IL-11Rα imobilizado como alvo num processo de enriquecimento seletivo de quatro rondas. Cada etapa aumentou o rigor das condições de lavagem para o isolamento de miniproteínas com atividade de ligação válida e de alta afinidade. Os clones de fagos individuais, obtidos após a última etapa de enriquecimento, foram selecionados através de ELISA para a sua interação com IL-11Rα e para o seu potencial de competir eficazmente com IL-11 na ligação ao recetor. Deste processo de seleção e triagem surgiram dois candidatos principais, nomeadamente DN226 e DN213. Estas duas miniproteínas demonstraram uma elevada ligação específica ao IL-11Rα, que foi validada quantitativamente através de ensaios ELISA. Significativamente, estes ensaios competitivos demonstraram a capacidade de ambos os candidatos inibirem a ligação da IL-11 ao seu recetor, destacando as suas capacidades em interromper o complexo IL-11/IL-11Rα/gp130 que é formado para sinalização. Destes, o DN226 exibiu afinidade superior, maior inibição competitiva contra a IL-11 e, em geral, um comportamento molecular mais promissor, identificando-o como a molécula mais adequada para desenvolvimento pré-clínico adicional. Este trabalho serve para destacar uma abordagem eficaz e robusta que permite a integração do design computacional de novo de proteínas com técnicas de seleção experimental no desenvolvimento de miniproteínas terapêuticas direcionadas a vias relevantes para doenças. Os resultados ilustram a capacidade de pequenas proteínas projetadas computacionalmente de reconhecer seletivamente um receptor de citocina complexo e interferir na sua interação com o ligante, representando uma nova geração de agentes antifibróticos. O estudo representa ainda uma valiosa prova de conceito de que a via de sinalização da IL-11, há muito implicada na progressão fibrótica, pode ser modulada com precisão através de estruturas proteicas racionalmente concebidas, em vez de grandes produtos biológicos. As direções futuras devem incluir um maior refinamento estrutural do DN226 para aumentar a estabilidade, a afinidade e a meia-vida sérica; validação funcional em modelos de fibroblastos e células epiteliais pulmonares; e avaliação em modelos animais de fibrose pulmonar para determinar a eficácia terapêutica in vivo. Além disso, estratégias de otimização como PEGilação, fusão Fc ou ciclização podem melhorar ainda mais as propriedades farmacocinéticas, apoiando o eventual desenvolvimento translacional. Em suma, as miniproteínas aqui descritas constituem uma base muito promissora para uma nova classe de terapêuticas antifibróticas direcionadas para o IL-11Rα. A sinergia atual entre o design biomolecular baseado em IA e as metodologias laboratoriais clássicas sublinha a viabilidade e o poder de tal abordagem para combater doenças complexas como a FPI.Com os avanços contínuos na tecnologia computacional, proteínas projetadas de novo, como a DN226, podem abrir caminho para terapias cada vez mais precisas, eficazes e acessíveis para doenças fibróticas e outras condições. | por |
| dc.identifier.tid | 204225701 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/29097 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Protein design | |
| dc.subject | Idiopathic pulmonary fibrosis | |
| dc.subject | IL-11 signaling | |
| dc.subject | Miniproteins | |
| dc.subject | Phage display | |
| dc.title | Development of IL-11 receptor targeting miniproteins | |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | mestrado em Biotecnologia |