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Unveiling a putative hairy-microtubules protein interaction in early Drosophila development
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Authors
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Abstract(s)
Animal development requires careful spatiotemporal positional information. Such information allows development of the different organs and tissues in the correct order and position during subsequent steps of differentiation. In Drosophila this is achieved through segmentation which divides the embryo in 14 segments: 3 segments make up the head with its antennae and mouth parts, 3 segments make up the thorax and 8 the abdomen. In Drosophila early embryogenesis, the embryo undergoes 13 rounds of rapid, synchronized nuclear division without cytokinesis, leading to the formation of a syncytial blastoderm with more than 6000 nuclei in a shared cytoplasm. The molecular events leading to larvae body segmentation are initiated by maternally derived signals and propagated by a genetic cascade of more than 30 different genes, culminating in the establishment of segment-specific gene expression patterns. To this purpose, the protein of that gene can only execute its function when it is in the correct position in the shared cytoplasm. This is achieved by selective silencing and active transport of the mRNA to the correct position, a process that normally requires the recognition of cis-acting elements, formation of ribonucleoproteins and Dynein-mediated transport along microtubules. In several cases, protein localization remains normal in conditions in which RNA localization is abrogated, implying additional mechanisms for segment individualization. hairy is a Drosophila pair-rule gene that regulates the development of alternate segments in the Drosophila embryo, and its mRNA location is achieved through dynein-mediated transport of RNA particles. Previous results from our lab found an interaction between chicken hairy1 and microtubule proteins in a yeast two-hybrid screen. We hypothesize that microtubule interaction of the hairy protein is conserved in Drosophila and plays a role in segment individualization. The aim of this master proposal is to investigate the interaction between hairy protein and microtubules in Drosophila. This will be performed using different genetic, biochemical and cell biology approaches. Namely, (1) in vivo imaging of hairy protein localization during successive stages of Drosophila embryo development, using a transgenic reporter line containing a fluorescent hairy fusion reporter; (2) sample preparation for mass-spectroscopy identification of hairy protein interactors; (3) in toto immunohistochemical detection of candidate hairy protein interactors; (4) in vivo imaging of hairy protein localization after microtubule depolymerization during early stages of development.
O desenvolvimento animal requer informações espaço temporais cuidadosas. Essas informações permitem o desenvolvimento dos diferentes órgãos e tecidos na ordem e posição corretas durante as etapas subsequentes de diferenciação. Em Drosophila, isso é alcançado através da segmentação, que divide o embrião em 14 segmentos: 3 segmentos formam a cabeça com as suas antenas e partes bucais, 3 segmentos formam o tórax e 8 o abdómen. Durante a embriogénese inicial de Drosophila, o embrião passa por 13 rondas de divisão nuclear rápida e sincronizada sem citocinese, levando à formação de uma blastoderme sincicial com mais de 6000 núcleos num citoplasma partilhado. Os eventos moleculares que levam à segmentação do corpo da larva são iniciados por sinais de origem materna e propagados por uma cascata genética composta por mais de 30 genes diferentes, culminando no estabelecimento de padrões de expressão génica específicos para cada segmento. Para este fim, a proteína desse gene só poderá executar a sua função corretamente localizada no citoplasma. Isto é conseguido através do silenciamento seletivo e do transporte ativo do mRNA para a posição correta, um processo que normalmente requer o reconhecimento de elementos cis regulatórios, formação de ribonucleoproteínas e transporte mediado por dineína ao longo dos microtúbulos. Em vários casos, a localização da proteína permanece normal em condições nas quais a localização do RNA é abrogada, implicando mecanismos adicionais para a individualização dos segmentos. hairy é um gene pair-rule de Drosophila que regula o desenvolvimento de segmentos alternados no embrião de Drosophila, e a localização do seu mRNA é alcançada através do transporte mediado por dineína de partículas de RNA. Resultados anteriores do nosso laboratório encontraram uma interação entre a hairy1 de galinha e proteínas de microtúbulos num ensaio de two-hybrid em levedura. Nós hipotetizamos que a interação com microtúbulos da proteína hairy é conservada em Drosophila e desempenha um papel na individualização dos segmentos. O objetivo desta proposta de mestrado é investigar a interação entre a proteína hairy e os microtúbulos em Drosophila. Isto será realizado utilizando diferentes abordagens genéticas, bioquímicas e de biologia celular. Nomeadamente, (1) imagem in vivo da localização da proteína hairy durante sucessivas etapas do desenvolvimento do embrião de Drosophila, usando uma linha transgénica contendo um repórter de fusão fluorescente de hairy; (2) preparação de x amostras para identificação de interatores da proteína hairy por espectrometria de massa; (3) deteção imunohistoquímica in toto de interatores candidatos da proteína hairy; (4) imagem in vivo da localização da proteína hairy após a despolimerização de microtúbulos durante as primeiras fases de desenvolvimento.
O desenvolvimento animal requer informações espaço temporais cuidadosas. Essas informações permitem o desenvolvimento dos diferentes órgãos e tecidos na ordem e posição corretas durante as etapas subsequentes de diferenciação. Em Drosophila, isso é alcançado através da segmentação, que divide o embrião em 14 segmentos: 3 segmentos formam a cabeça com as suas antenas e partes bucais, 3 segmentos formam o tórax e 8 o abdómen. Durante a embriogénese inicial de Drosophila, o embrião passa por 13 rondas de divisão nuclear rápida e sincronizada sem citocinese, levando à formação de uma blastoderme sincicial com mais de 6000 núcleos num citoplasma partilhado. Os eventos moleculares que levam à segmentação do corpo da larva são iniciados por sinais de origem materna e propagados por uma cascata genética composta por mais de 30 genes diferentes, culminando no estabelecimento de padrões de expressão génica específicos para cada segmento. Para este fim, a proteína desse gene só poderá executar a sua função corretamente localizada no citoplasma. Isto é conseguido através do silenciamento seletivo e do transporte ativo do mRNA para a posição correta, um processo que normalmente requer o reconhecimento de elementos cis regulatórios, formação de ribonucleoproteínas e transporte mediado por dineína ao longo dos microtúbulos. Em vários casos, a localização da proteína permanece normal em condições nas quais a localização do RNA é abrogada, implicando mecanismos adicionais para a individualização dos segmentos. hairy é um gene pair-rule de Drosophila que regula o desenvolvimento de segmentos alternados no embrião de Drosophila, e a localização do seu mRNA é alcançada através do transporte mediado por dineína de partículas de RNA. Resultados anteriores do nosso laboratório encontraram uma interação entre a hairy1 de galinha e proteínas de microtúbulos num ensaio de two-hybrid em levedura. Nós hipotetizamos que a interação com microtúbulos da proteína hairy é conservada em Drosophila e desempenha um papel na individualização dos segmentos. O objetivo desta proposta de mestrado é investigar a interação entre a proteína hairy e os microtúbulos em Drosophila. Isto será realizado utilizando diferentes abordagens genéticas, bioquímicas e de biologia celular. Nomeadamente, (1) imagem in vivo da localização da proteína hairy durante sucessivas etapas do desenvolvimento do embrião de Drosophila, usando uma linha transgénica contendo um repórter de fusão fluorescente de hairy; (2) preparação de x amostras para identificação de interatores da proteína hairy por espectrometria de massa; (3) deteção imunohistoquímica in toto de interatores candidatos da proteína hairy; (4) imagem in vivo da localização da proteína hairy após a despolimerização de microtúbulos durante as primeiras fases de desenvolvimento.
Description
Keywords
Hairy Microtubule Pair-rule gene Embryogenesis Drosophila