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Isolation and analysis of the terpene synthases codifying sequences from the aromatic plants: thymus albicans and Thymus mastichina
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Abstract(s)
A família Lamiaceae engloba um conjunto de espécies onde se inclui o género Thymus.
Plantas do género Thymus são conhecidas pelas suas propriedades aromáticas de
elevado potencial comercial e económico, com várias aplicações na medicina
tradicional ou como plantas aromáticas de interiores e no uso de fragrâncias em
sabonetes, perfumes e detergentes. Estas características são conferidas pelos óleos
essenciais produzidos por estruturas especializadas denominadas de tricomas
glandulares que se encontram nos seus órgãos aéreos. Esta família apresenta dois tipos
de tricomas glandulares, os tricomas peltados e os capitados, sendo os primeiros os
maiores contribuintes para a síntese do óleo essencial. O óleo essencial produzido é
composto por uma mistura heterogénea de metabolitos maioritariamente secundários,
como alcalóides, fenóis, aldeídos e terpenos, sendo esta última a classe de compostos
mais abundante. Os terpenos são a maior família de produtos naturais, com
aproximadamente 20 000 compostos que se dividem em várias classes de acordo com o
número de átomos de carbono que os constituem, sendo denominados de monoterpenos
(C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpenos (C30) e são sintetizados
respectivamente pelas monoterpeno, sesquiterpeno, diterpeno e triterpeno sintases. Os
monoterpenos são sintetizados a partir do geranil difosfato (GDP) e requerem a
presença de dois metais divalentes (Mn2+ ou Mg2+) para a sua ionização em 3R- ou 3Slinalil
difosfato (LDP, dependendo da posição inicial do geranil difosfato). A partir
deste intermediário universal a reacção pode adoptar vários fins, podendo desta forma
resultar na síntese de diferentes terpenóides. As monoterpeno sintases são caracterizadas
pela presença de várias regiões conservadas, entre as quais os motivos DDXXD e
(M/L)L(S/Q/N)L(F/Y)EAS que estão envolvidos na interacção com os metais
divalentes e na sua actividade enzimática.
O objectivo deste trabalho consistiu em isolar e caracterizar as sequências codificantes
de duas monoterpeno sintases presentes em plantas do género Thymus, respectivamente
Thymus albicans Hoffmans & Link quimiótipo cineol e Thymus mastichina (L.) L. spp.
mastichina quimiótipo linalol. Neste estudo a região codificante das enzimas 1,8-cineol
e linalol sintases, que estão envolvidas na síntese dos monoterpenos 1,8-cineol e linalol,
monoterpenos predominantes nos óleos essenciais das plantas em estudo, foram
isoladas, totalmente ou parcialmente e os tricomas glandulares caracterizados a nível
estrutural em T. albicans. Inicialmente avaliou-se a distribuição de tricomas peltados
nos órgãos aéreos de T. albicans e constatou-se que os tricomas peltados se encontram em maior abundância nas folhas, brácteas e sépalas, em comparação com o ovário e as
pétalas. Observações ao microscópio óptico das secções das folhas revelaram que a
estrutura dos tricomas peltados de T. albicans é similar à maioria das espécies da
família Lamiaceae, apresentando uma célula basal ligada à epiderme da folha seguindose
uma célula pedícular e uma cabeça composta por células secretoras distribuídas por
dois círculos concêntricos, com 8 células secretoras em torno de 4 células centrais. Em
contrapartida, os tricomas capitados são compostos por duas células pediculares e uma
cabeça alongada, maior que as células pediculares. A estrutura apresentada pelos
tricomas capitados contrasta com a maioria dos tricomas observados na família
Lamiaceae, que são caracterizados por apresentarem uma célula pedicular maior que
metade do comprimento da cabeça. Com base nestas observações as folhas foram o
órgão da planta seleccionado para isolar a sequência codificante destas enzimas a partir
do seu RNA total. Este estudo não incluiu a caracterização dos tricomas dos órgãos
aéreos de T. mastichina devido à difícil disponibilidade do material vegetal desta
espécie e também porque os seus tricomas glandulares já foram analisados em outros
estudos.
A estratégia utilizada para isolar a região codificante das enzimas baseou-se na
amplificação do DNA (PCR e PCR-RACE) utilizando primers degenerados em zonas
conservadas da sequência nucleotídica, tais como as regiões DDXXD e
(M/L)L(S/Q/N)L(F/Y)EAS ou em regiões especificas do transcripto amplificado em
cDNA de folha de T. albicans e T. mastichina. Como resultado obteve-se a sequência
completa correspondente à região codificante de uma possível 1,8-cineol sintase de
T. albicans (TalbCyn), com 1857 pb e 70% de similaridade com a 1,8-cineol de
Rosmarinus officinalis. Obtiveram-se também dois fragmentos de possíveis
monoterpeno sintases em T. albicans com 972 pb (TalbLin) e T. mastichina com 795 pb
(TmlCyn), que partilham 71% de similaridade com uma linalol sintase de Perilla
setoyensis e com 57% de similaridade para com a 1,8-cineol sintase de Rosmarinus
officinalis, respectivamente.
Alinhamentos entre as sequências de aminoácidos de TalbCyn, TmlCyn, TalbLin e
outras 1,8-cineol sintases e linalool sintases revelou motivos característicos dos
membros desta família (RRX8W, DDXXD, (M/L)L(S/Q/N)L(F/Y)EAS e
(N/D)DX2(S/T)X3E) e também três regiões (região 1, região 2 e região 3) menos
conservados entre as 1,8-cineol e linalol sintases, que podem ser determinantes para a
estrutura terciária das proteínas, conferindo-lhes especificidade na síntese do produto.
viii
TalbLin apresenta uma substituição no motivo DDXXD no último ácido aspártico (D)
por uma serina (S), o que poderá justificar o baixo rendimento de extracção de linalol
(0.4%) comparando com 1,8-cineol (67.9%) em T. albicans verificado em estudos
anteriores. A Região1 menos conservada, presente em ambas as sequências isoladas,
contém um resíduo de asparagina que não está presente em TalbLin e está envolvido na
deprotonação da água necessária para a síntese do 1,8-cineol. A Região 3, sendo uma
região característica das terpeno ciclases, está presente nas ciclases 1,8-cineol sintases
mas não se encontra nas acíclicas linalol sintases. Estas diferenças encontradas entre as
1,8-cineol e linalol sintases reflectem diferenças por parte das enzimas na especificidade
do produto, resultando na síntese de diferentes monoterpenos.
Para caracterizar funcionalmente as enzimas isoladas, a região correspondente à
proteína madura da 1,8-cineol sintase de T. albicans, respectivamente a partir da região
RRX8W, foi clonada no vector de expressão pCR®T7/NT-TOPO® utilizando o
hospedeiro E. coli BL21 (DE3) e incluindo uma cauda de histidinas na sua extremidade
amino-terminal para possibilitar o isolamento e purificação da proteina recombinante
produzida. Ensaios preliminares de indução da expressão na presença de 0.7 mM de
IPTG a 20 ºC foram realizados para avaliar o padrão de expressão da proteina
recombinada e o extracto proteico da fracção insolúvel de amostras da cultura retiradas
no final de 4, 10, 24, 48 e 72 horas foram analisadas por SDS-PAGE. Após 10 horas de
indução, obteve-se na fracção insolúvel uma proteína com 70 KDa, peso molecular
aproximado ao estimado para a proteína recombinante, 72.92 KDa respectivamente. No
entanto, a identidade desta proteina carece ainda de ser confirmada através de Western
blot, com anticorpos específicos para a cauda de histidinas e por sequenciação.
De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho constituem os passos iniciais
que permitirão o isolamento e caracterização das enzimas 1,8-cineol e linalol sintases de
T. albicans e T. mastichina, com o objectivo de elucidar o mecanismo reaccional
complexo das monoterpeno sintases.
Description
Keywords
Thymus Monoterpeno Sintases Tricomas Terpenos