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Publication
Zebrafish as a model to study brain pathologies associated to mef2c mutations and haploinsufficiency
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Advisor(s)
Abstract(s)
The MRD20 syndrome is caused by an haploinsu ciency of the MEF2C gene. This disease
causes patients to display mental retardation, absence of speech, limited walking abilities,
and is considered one of the main causes of intellectual disability.
MEF2C belongs to the MEF2 family of transcription factors, which is crucial for cell
development and di erentiation, but unlike other MEF2 proteins, MEF2C is restricted to
muscle, brain and spleen.
Zebra sh possesses two copies of the mef2c gene: mef2ca and mef2cb, and in this study
we used one mutant line for each of the gene.
The main concern in this work was to analyse whether zebra sh is able to model mef2c
haploinsu ciency using the zebra sh mutants.
First, we analysed the syntenic arrangement of the genes surrounding mef2c and concluded
that the pattern of neighbouring genes is conserved among di erent species.
Following a previous work we investigated the putative binding of Mef2c to mecp2 promoter.
However, no e ects were detected in the mecp2 promoter by Mef2ca and Mef2cb,
alone or together, suggesting that there may lacking co-factors for this binding to occur.
In order to understand if mef2c mutations cause impairment in locomotion or memory,
we performed locomotor and learning experiments in zebra sh mutants. The results showed
a decrease in coiling activity, an increase in covered distance and activity percentage from
mutants to the WT larvae. In the memory tests we found some di erences between mutants
and the WT sh.
We further explored the expression of putative Mef2c target genes in Mef2c mutant
zebra sh using quantitative polymerase chain reaction. Our results suggested that emx1
was highly expressed in mef2cb heterozygous mutants, suggesting an impairment of the
telencephalon.
These observations suggest that zebra sh Mef2c mutant sh, serve as good animal models
to study the mef2c haploinsu ciency.
O gene Mef2c é um dos genes da família de fatores de transcrição MEF2. Esta família é considerada um antigo mediador da transcrição e da diferenciação celular. Os fatores de transcrição MEF2 são caracterizados por uma MADS-box na sua extremidade N-terminal e um domínio MEF2 adjacente. Em conjunto estes domínios ligam-se a uma sequência especí- ca de DNA, CTA(A/T)4TAG/A, medeiam a dimerização com outras proteínas homólogas e interagem com co-fatores. A sua região C-terminal contém um domínio HJURP-C, dois domínios de transactivação e um domínio de localização nuclear, e é sujeita a um splicing alternativo complexo. A família MEF2 controla a diferenciação celular, a proliferação celular, a morfogénese celular e tanto a sobrevivência como a apoptose celular. Contrariamente às restantes proteínas MEF2, o MEF2C é restrito ao músculo, cérebro e baço. O gene MEF2C sofre diversos splicings alternativos, de modo a combinar, de diferentes formas, os exões 1, 2, e e assim dar origem a variantes transcricionais que serão expressas em locais diferentes: os exões 1 e são expressos em todos os tecidos, o exão 2 é expresso no músculo e o exão é expresso exclusivamente no cérebro. Durante o curso da evolução, a classe teleostei passou por um fenómeno de duplicação do genoma. Isto faz com que o peixe-zebra (que pertence a essa classe) possua duas cópias de diversos genes. Um desses genes é o mef2c. O peixe-zebra possui duas cópias do gene mef2c: mef2ca e mef2cb, que estão localizados nos cromossomas 10 e 5, respetivamente. Ambos, têm a mesma organização geral que o gene humano. Para o gene mef2ca existem três linhas mutantes, mas apenas uma foi utilizada neste trabalho (mef2cab1086). No caso do gene mef2cb apenas existe uma linha mutante: mef2cbfh288, sendo a utilizada no decurso deste trabalho. Os modelos animais para desordens neuronais são uma ferramenta essencial para a disse ção dos mecanismos que estão por detrás destas doenças. O peixe-zebra tornou-se o modelo animal preferido de geneticistas e neurobiólogos devido à existência de uma arquitetura neural altamente conservada que facilita comparações com outras espécies de vertebrados. Estes possuem áreas de nidas similares tal como o hipotálamo e o bolbo olfatório, que é homólogo ao hipocampo. O MEF2C, sendo uma proteína altamente expressa no cérebro, quando malformada, está associada a diversas patologias cerebrais, como é o caso da doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a Esclerose Lateral Amiotró ca e a síndrome MRD20. A síndrome MRD20 provém de uma haploinsu ciência do gene mef2c, e é caracterizada por atraso mental severo, ausência da fala, capacidades de marcha limitada, epilepsia, hipotonia muscular, diversas anomalias cerebrais, entre outros sintomas, e é considerada uma das principais causas de incapacidade intelectual. Existem também uma série de malformações tanto faciais, como é o caso de boca e queixo pequenos e orelhas grandes, como de outros tecidos, tais como o rim, o coração e os ossos. O principal objetivo deste trabalho foi inferir a capacidade para usar o peixe-zebra para modelar a patologia da haploinsu ciência do gene mef2c. Posto isto, de modo a investigar o papel dos genes mef2ca e mef2cb no desenvolvimento do cérebro, foram realizados diversos testes experimentais nas áreas da criohistologia, onde se seccionaram cérebros de peixe-zebra a frio; da análise de expressão genética, onde se avaliou o impacto das mutações (mef2cab1086 e mef2cbfh288) na expressão de diversos genes associados ao desenvolvimento do cérebro; e da biologia comportamental, onde se avaliou tanto a capacidade motora de larvas de peixezebra, como a capacidade intelectual (memória e aprendizagem) de peixes adultos. Foram também realizadas análises in silico e in vitro para avaliar se os factores de transcrição Mef2ca e Mef2cb regulam a transcrição do gene mecp2, cuja expressão está dimuida nos peixes mutantes mef2cab1086 e mef2cbfh288. O gene mecp2 está envolvido no desenvolvimento do cérebro e em pacientes com haploinsu ciência de MEF2C a sua expressão está diminuida. Através de uma análise de sintenia, veri cou-se que o gene mef2cb é que se encontra evolutivamente mais próximo do gene grp de tetrápodes. Isto deve-se ao facto da maioria dos genes que fazem fronteira com o gene mef2cb em peixe-zebra, se encontrarem conservados noutras espécies. Estes resultados, juntamente com outros anteriormente obtidos no grupo BIOSKEL, indicam uma conservação de características do gene MEF2C de humano para peixe zebra. Trabalhos anteriores indicam uma possível ligação entre os factores de transcrição Mef2c e o gene mecp2. No entanto, nenhum efeito foi detetado no promotor do gene mecp2, nem pelo Mef2ca nem pelo Mef2cb, sozinhos ou em conjunto, o que pode signi car que nesta via está em falta a acção de co-factores. Este resultado deixa, assim, a relação entre o mecp2 e o Mef2c ainda por comprovar. Visto que os efeitos neurológicos da haploinsu ciência do gene mef2c são tão proeminentes, nós hipotetizamos que poderiam existir alterações no cérebro ao nível da sua estrutura e volume. Posto isto, fomos procurar essas alterações através da caracterização de cérebros de peixes mutados. Relativamente aos testes comportamentais, observaram-se diferenças entre peixes mutantes, para ambas as mutações, e peixes WT, tanto ao nível da memória como ao nível da aprendizagem. Na primeira experiência, foram os mutantes heterozigóticos para o gene mef2cb que mostraram mais di culdades de memória. Surpreendentemente, na segunda experiência, foram os peixes WT que tiveram mais di culdades em reter o que tinham aprendido. Apesar destes resultados, não é possível extrair conclusões diretas porque não foi possível apontar a signi cância dessas diferenças. Os peixes mef2cab1086=+ e mef2cbfh288=+ mostraram ainda um comportamento inquanti cável que seria interessante investigar futuramente. Estudos anteriores realizados no laboratório, tinham sugerido através da análise de express ão de genes nas linhas mutantes, que ambos os ortólogos, Mef2ca e Mef2cb, poderão estar envolvidos no desenvolvimento cerebral, uma vez que a perda de função de ambos leva a uma variação de expressão signi cativa nos genes cdkl5 e mecp2, dois genes envolvidos no desenvolvimento cerebral em humanos e cuja sob-expressão foi observada anteriormente em pacientes com haploinsu ciência de MEF2C. Neste trabalho, analisámos a expressão relativa de seis genes descritos como sendo expressos no cérebro, e veri cámos que o gene emx1 é altamente expresso nos mutantes homozigóticos para o gene mef2cb, sugerindo uma possível de ciência no telencéfalo. Em humanos, a proteína EMX1 está envolvida na especi cação de células no desenvolvimento do sistema nervoso central e também participa no desenvolvimento de neurónios olfativos. De forma a complementar os resultados obtidos nas análises com estes peixes mutantes a nível craniofacial, no decorrer do nosso trabalho elaborámos uma série de testes para avaliar o desenvolvimento cerebral dos peixes mutantes. Os testes locomotores efetuados mostraram um decréscimo na actividade de contração em todas as larvas mutantes com 1 dia após a fertilização, mas nenhuma alteração na frequência de contrações duplas. Estes movimentos de contração acontecem em embriões de diversos peixes e crê-se que sejam a causa da eclosão dos ovos. Para além disto, alterações no padrão de contração dos embriões pode levar a falhas na formação da rede neural. Aos 6 dias após a fertilização existe um aumento tanto na distância total coberta pelas larvas como na percentagem de tempo em atividade, em relação a larvas WT. Para além disto, também foi possível agrupar as tendências das métricas utilizadas, de modo a fazer surgir um padrão de associação de comportamentos com interesse para investigar no futuro. Concluindo, podemos dizer que o peixe-zebra é, de facto, um bom candidato para modelar a haploinsu ciência do gene mef2c. No entanto, serão necessários mais estudos de forma a inferir, com certeza, a sua utilidade.
O gene Mef2c é um dos genes da família de fatores de transcrição MEF2. Esta família é considerada um antigo mediador da transcrição e da diferenciação celular. Os fatores de transcrição MEF2 são caracterizados por uma MADS-box na sua extremidade N-terminal e um domínio MEF2 adjacente. Em conjunto estes domínios ligam-se a uma sequência especí- ca de DNA, CTA(A/T)4TAG/A, medeiam a dimerização com outras proteínas homólogas e interagem com co-fatores. A sua região C-terminal contém um domínio HJURP-C, dois domínios de transactivação e um domínio de localização nuclear, e é sujeita a um splicing alternativo complexo. A família MEF2 controla a diferenciação celular, a proliferação celular, a morfogénese celular e tanto a sobrevivência como a apoptose celular. Contrariamente às restantes proteínas MEF2, o MEF2C é restrito ao músculo, cérebro e baço. O gene MEF2C sofre diversos splicings alternativos, de modo a combinar, de diferentes formas, os exões 1, 2, e e assim dar origem a variantes transcricionais que serão expressas em locais diferentes: os exões 1 e são expressos em todos os tecidos, o exão 2 é expresso no músculo e o exão é expresso exclusivamente no cérebro. Durante o curso da evolução, a classe teleostei passou por um fenómeno de duplicação do genoma. Isto faz com que o peixe-zebra (que pertence a essa classe) possua duas cópias de diversos genes. Um desses genes é o mef2c. O peixe-zebra possui duas cópias do gene mef2c: mef2ca e mef2cb, que estão localizados nos cromossomas 10 e 5, respetivamente. Ambos, têm a mesma organização geral que o gene humano. Para o gene mef2ca existem três linhas mutantes, mas apenas uma foi utilizada neste trabalho (mef2cab1086). No caso do gene mef2cb apenas existe uma linha mutante: mef2cbfh288, sendo a utilizada no decurso deste trabalho. Os modelos animais para desordens neuronais são uma ferramenta essencial para a disse ção dos mecanismos que estão por detrás destas doenças. O peixe-zebra tornou-se o modelo animal preferido de geneticistas e neurobiólogos devido à existência de uma arquitetura neural altamente conservada que facilita comparações com outras espécies de vertebrados. Estes possuem áreas de nidas similares tal como o hipotálamo e o bolbo olfatório, que é homólogo ao hipocampo. O MEF2C, sendo uma proteína altamente expressa no cérebro, quando malformada, está associada a diversas patologias cerebrais, como é o caso da doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a Esclerose Lateral Amiotró ca e a síndrome MRD20. A síndrome MRD20 provém de uma haploinsu ciência do gene mef2c, e é caracterizada por atraso mental severo, ausência da fala, capacidades de marcha limitada, epilepsia, hipotonia muscular, diversas anomalias cerebrais, entre outros sintomas, e é considerada uma das principais causas de incapacidade intelectual. Existem também uma série de malformações tanto faciais, como é o caso de boca e queixo pequenos e orelhas grandes, como de outros tecidos, tais como o rim, o coração e os ossos. O principal objetivo deste trabalho foi inferir a capacidade para usar o peixe-zebra para modelar a patologia da haploinsu ciência do gene mef2c. Posto isto, de modo a investigar o papel dos genes mef2ca e mef2cb no desenvolvimento do cérebro, foram realizados diversos testes experimentais nas áreas da criohistologia, onde se seccionaram cérebros de peixe-zebra a frio; da análise de expressão genética, onde se avaliou o impacto das mutações (mef2cab1086 e mef2cbfh288) na expressão de diversos genes associados ao desenvolvimento do cérebro; e da biologia comportamental, onde se avaliou tanto a capacidade motora de larvas de peixezebra, como a capacidade intelectual (memória e aprendizagem) de peixes adultos. Foram também realizadas análises in silico e in vitro para avaliar se os factores de transcrição Mef2ca e Mef2cb regulam a transcrição do gene mecp2, cuja expressão está dimuida nos peixes mutantes mef2cab1086 e mef2cbfh288. O gene mecp2 está envolvido no desenvolvimento do cérebro e em pacientes com haploinsu ciência de MEF2C a sua expressão está diminuida. Através de uma análise de sintenia, veri cou-se que o gene mef2cb é que se encontra evolutivamente mais próximo do gene grp de tetrápodes. Isto deve-se ao facto da maioria dos genes que fazem fronteira com o gene mef2cb em peixe-zebra, se encontrarem conservados noutras espécies. Estes resultados, juntamente com outros anteriormente obtidos no grupo BIOSKEL, indicam uma conservação de características do gene MEF2C de humano para peixe zebra. Trabalhos anteriores indicam uma possível ligação entre os factores de transcrição Mef2c e o gene mecp2. No entanto, nenhum efeito foi detetado no promotor do gene mecp2, nem pelo Mef2ca nem pelo Mef2cb, sozinhos ou em conjunto, o que pode signi car que nesta via está em falta a acção de co-factores. Este resultado deixa, assim, a relação entre o mecp2 e o Mef2c ainda por comprovar. Visto que os efeitos neurológicos da haploinsu ciência do gene mef2c são tão proeminentes, nós hipotetizamos que poderiam existir alterações no cérebro ao nível da sua estrutura e volume. Posto isto, fomos procurar essas alterações através da caracterização de cérebros de peixes mutados. Relativamente aos testes comportamentais, observaram-se diferenças entre peixes mutantes, para ambas as mutações, e peixes WT, tanto ao nível da memória como ao nível da aprendizagem. Na primeira experiência, foram os mutantes heterozigóticos para o gene mef2cb que mostraram mais di culdades de memória. Surpreendentemente, na segunda experiência, foram os peixes WT que tiveram mais di culdades em reter o que tinham aprendido. Apesar destes resultados, não é possível extrair conclusões diretas porque não foi possível apontar a signi cância dessas diferenças. Os peixes mef2cab1086=+ e mef2cbfh288=+ mostraram ainda um comportamento inquanti cável que seria interessante investigar futuramente. Estudos anteriores realizados no laboratório, tinham sugerido através da análise de express ão de genes nas linhas mutantes, que ambos os ortólogos, Mef2ca e Mef2cb, poderão estar envolvidos no desenvolvimento cerebral, uma vez que a perda de função de ambos leva a uma variação de expressão signi cativa nos genes cdkl5 e mecp2, dois genes envolvidos no desenvolvimento cerebral em humanos e cuja sob-expressão foi observada anteriormente em pacientes com haploinsu ciência de MEF2C. Neste trabalho, analisámos a expressão relativa de seis genes descritos como sendo expressos no cérebro, e veri cámos que o gene emx1 é altamente expresso nos mutantes homozigóticos para o gene mef2cb, sugerindo uma possível de ciência no telencéfalo. Em humanos, a proteína EMX1 está envolvida na especi cação de células no desenvolvimento do sistema nervoso central e também participa no desenvolvimento de neurónios olfativos. De forma a complementar os resultados obtidos nas análises com estes peixes mutantes a nível craniofacial, no decorrer do nosso trabalho elaborámos uma série de testes para avaliar o desenvolvimento cerebral dos peixes mutantes. Os testes locomotores efetuados mostraram um decréscimo na actividade de contração em todas as larvas mutantes com 1 dia após a fertilização, mas nenhuma alteração na frequência de contrações duplas. Estes movimentos de contração acontecem em embriões de diversos peixes e crê-se que sejam a causa da eclosão dos ovos. Para além disto, alterações no padrão de contração dos embriões pode levar a falhas na formação da rede neural. Aos 6 dias após a fertilização existe um aumento tanto na distância total coberta pelas larvas como na percentagem de tempo em atividade, em relação a larvas WT. Para além disto, também foi possível agrupar as tendências das métricas utilizadas, de modo a fazer surgir um padrão de associação de comportamentos com interesse para investigar no futuro. Concluindo, podemos dizer que o peixe-zebra é, de facto, um bom candidato para modelar a haploinsu ciência do gene mef2c. No entanto, serão necessários mais estudos de forma a inferir, com certeza, a sua utilidade.
Description
Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2017
Keywords
Peixe-zebra Comportamento Mef2ca Mef2cb Desenvolvimento cerebral Análise de expressão