Loading...
Publication
Unlocking cyanobacterial metabolic potential: ß-oxidation pathway
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 9.9 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Cyanobacteria are a very diverse phylum of photosynthetic prokaryotes. As the first known organisms to produce oxygen on Earth, these microorganisms were crucial to the development of the biosphere and early Earth life forms. Cyanobacteria still presents several undefined genomic and metabolic pathways, despite their relevance, namely as a promising biological alternative to overcome the increasing demand for sustainable fuels and plastics. One of the still unclear pathways in cyanobacteria is b-oxidation, the catabolic process of fatty acid (FA) degradation. This mechanism had been thought to be universal for all organisms; however, some studies have suggested that b-oxidation might be lacking in cyanobacteria, despite the scattered evidence to support this hypothesis. We have revealed unprecedented results that may help finally understand this fundamental metabolic pathway in cyanobacteria. Through the bioinformatic analysis performed, some cyanobacteria strains were shown to encode putative fatty acid degradation (fad)
machinery. Genomic context analysis led to the identification of a previously uncharacterized gene, here called AMP-L, that completes the full set of fad genes required for fatty acid activation and subsequent entry into the b-oxidation pathway. With the protocol optimized in this work, cyanobacterial fatty acyl-CoA intermediates with different length chains were detected for the first time. Different in vivo FA supplementation assays support these findings, showing for the firsttime cyanobacteria strains that might be able to degrade FA. These results address several fundamental questions related to cyanobacteria evolution and FA metabolism. Furthermore, this study brings knowledge that would, ultimately, lead to more efficient metabolism engineering applied to biotechnological purposes.
As cianobactérias representam um filo de procariotas autotróficos Gram-negativos de grande relevância evolutiva, ecológica e biotecnológica. Estes organismos foram os primeiros a realizar fotossíntese, tendo desempenhado um papel importante na evolução e desenvolvimento da vida primitiva na Terra, possibilitando o aumento do oxigénio atmosférico durante o Grande Evento de Oxidação (há 2,4 mil milhões de anos) e, consequentemente, permitindo a evolução de organismos mais complexos. Atualmente, as cianobactérias são responsáveis por 20-30% da fixação global de carbono e, juntamente com outros organismos fitoplanctónicos, representam cerca de metade de toda a atividade fotossintética da Terra. As interações das cianobactérias com outros microrganismos também demonstram impactos ecológicos cruciais, permitindo-lhes colonizar uma ampla variedade de habitats, que vão desde ecossistemas terrestres até ecossistemas aquáticos, águas salobras a doces, e fontes termais a ambientes extremos do Ártico. Estes organismos utilizam o carbono fixado na forma de glicose, muitas vezes combinado com outros elementos, como fósforo e/ou azoto, para criar componentes estruturais essenciais como proteínas, hidratos de carbono e lípidos. Os lípidos das cianobactérias são essenciais para a sua integridade estrutural e funcionalidade, estando presentes nas membranas plasmática e externa, bem como na rede interna de membranas dos tilacoides, onde se localizam as cadeias de transferência de eletrões para os processos de fotossíntese e respiração. Estas membranas são caracterizadas por uma vasta diversidade de lípidos, compostos por quatro grupos: monogalactosil diacilglicerol (MGDG), digalactosil diacilglicerol (DGDG), sulfoquinovosil diacilglicerol (SQDG) e fosfatidilglicerol (PG), e um grupo de hidrocarbonetos. Os lípidos constituem um grupo diverso de moléculas orgânicas hidrofóbicas ou anfipáticas, que incluem os ácidos gordos (AGs) e os seus derivados. Os AGs são caracterizados pela presença de longas cadeias hidrocarbonadas e grupos carboxilo, componentes que são fundamentais e que contribuem para a estrutura e função de várias classes de lípidos. Os AGs representam então uma importante fonte de energia metabólica, que pode ser armazenada nas cianobactérias sob a forma de lípidos. As cianobactérias têm a capacidade de incorporar ácidos gordos livres exógenos (AGLEs) diretamente do ambiente, através da enzima acil-ACP sintetase (Aas). Uma vez ligados a uma holo-ACP, o tioéster acil-ACP torna-se um substrato para a via de biossíntese de lípidos, podendo ser alongado posteriormente. Os genes relacionados com a biossíntese de AGs (genes fab) nos genomas de cianobactérias são altamente conservados e mostram homologia significativa com os encontrados em Escherichia coli. No entanto, a via de degradação de AGs (ciclo de β-oxidação) nunca foi descrita em cianobactérias, e a presença de genes de degradação de AGs (genes fad) nesses organismos é desconhecida. Em E. coli, por exemplo, a degradação de AGLEs, e outros AGs livres são ativados pela FadD na forma de tioésteres de acil-CoA, posteriormente entrando no ciclo de β-oxidação. Este processo cíclico envolve quatro reações realizadas por três proteínas Fad. Inicia-se com uma primeira oxidação do acil-CoA pela acil-CoA desidrogenase (FadE), seguida de três reações catalisadas por um complexo tri-funcional (FadBA): uma hidratação e uma segunda oxidação pela 2-enoyl-CoA hidratase e 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase (FadB), e uma clivagem tiolítica final pela 3-cetoacil- CoA tiolase (FadA). Em cada ciclo de β-oxidação, um acil-CoA é encurtado em dois carbonos, libertando uma unidade de acetil-CoA, uma molécula chave que entra no ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs) para posterior produção de energia. Os lípidos das cianobactérias oferecem um valor biotecnológico imenso, impulsionando o seu uso como fábricas celulares microbianas sustentáveis em setores como a produção de biocombustíveis e bioplásticos, sublinhando a importância do seu estudo. Apesar da importância biotecnológica das cianobactérias, várias das suas vias metabólicas e genómicas permanecem pouco compreendidas, particularmente no que diz respeito ao seu metabolismo lipídico. Este estudo mostra, pela primeira vez, evidências bioinformáticas, bioquímicas e in vivo abrangentes que suportam a existência de uma via metabólica central nas cianobactérias, permitindo a descoberta de novas dimensões do seu potencial metabólico e estabelecendo uma nova base para futuros avanços biotecnológicos. A análise bioinformática realizada mostrou estirpes de cianobactérias que codificam uma maquinaria putativa de degradação de AGs (fad), homologa à presente em E. coli. É de notar a ausência do gene fadD praticamente nos genomas dessas cianobactérias. No entanto, através da análise do contexto genómico, um gene anteriormente não caracterizado, aqui denominado AMP-L, mostrou completar o conjunto de genes fad necessários para a via de β-oxidação nos genomas de cianobactérias, estando agrupado no mesmo cluster. Este gene, embora não homólogo do gene fadD, pertence à mesma superfamília de ligases dependentes de AMP. Dos 2876 genomas analisados, 157 continham o conjunto completo de genes fadB, fadA, fadE e AMP-L, incluindo a estirpe Cyanothece sp. PCC 7425 utilizada neste estudo. A estirpe Synechocystis sp. PCC 6803, utilizada também neste trabalho, não apresentou evidências da presença de genes putativos do processo de β-oxidação no seu genoma. Neste trabalho, também procurámos desvendar a função da proteína codificada pelo gene AMP-L de forma a caracterizar a sua função, que hipotetizamos ser homóloga à FadD. No entanto, futuros esforços devem concentrar-se na otimização da purificação da proteína AMP-L e na realização de ensaios enzimáticos adicionais para confirmar a atividade in vitro da acil-CoA ligase. Embora a deteção de intermediários de tioésteres de acil-CoA in vitro não tenha sido possível, esses intermediários foram identificados in vivo em culturas de Cyanothece sp. PCC 7425 e Synechocystis sp. PCC 6803, com comprimentos variáveis de cadeias de AGs, o que reforça a possível presença de um mecanismo de degradação de AGs. O protocolo otimizado neste estudo, permitiu a deteção de tioésteres de acil-CoA pela primeira vez em cianobactérias. Surpreendentemente, Synechocystis sp. PCC 6803, que não codifica os genes putativos de β-oxidação, apresentou resultados semelhantes aos da estirpe Cyanothece sp. PCC 7425. A presença de intermediários de acil-CoA em Synechocystis sp. PCC 6803 sugere que esta estirpe poderá ter uma via de degradação de AGs ainda não descoberta, ou outra rota metabólica que envolva intermediários de acil-CoA. Após experiências de suplementação com AGs marcados isotopicamente com carbono-13 (13C), verificou-se a presença de cadeias de AGs isotopicamente marcadas mais curtos nos lípidos membranares analisados em Cyanothece sp. PCC 7425 e Synechocystis sp. PCC 6803. No geral, este estudo representa uma ferramenta fundamental para avanços na área da bioengenharia, biotecnologia, abrindo novas possibilidades para aplicações inovadoras que aproveitem o potencial metabólico das cianobactérias.
As cianobactérias representam um filo de procariotas autotróficos Gram-negativos de grande relevância evolutiva, ecológica e biotecnológica. Estes organismos foram os primeiros a realizar fotossíntese, tendo desempenhado um papel importante na evolução e desenvolvimento da vida primitiva na Terra, possibilitando o aumento do oxigénio atmosférico durante o Grande Evento de Oxidação (há 2,4 mil milhões de anos) e, consequentemente, permitindo a evolução de organismos mais complexos. Atualmente, as cianobactérias são responsáveis por 20-30% da fixação global de carbono e, juntamente com outros organismos fitoplanctónicos, representam cerca de metade de toda a atividade fotossintética da Terra. As interações das cianobactérias com outros microrganismos também demonstram impactos ecológicos cruciais, permitindo-lhes colonizar uma ampla variedade de habitats, que vão desde ecossistemas terrestres até ecossistemas aquáticos, águas salobras a doces, e fontes termais a ambientes extremos do Ártico. Estes organismos utilizam o carbono fixado na forma de glicose, muitas vezes combinado com outros elementos, como fósforo e/ou azoto, para criar componentes estruturais essenciais como proteínas, hidratos de carbono e lípidos. Os lípidos das cianobactérias são essenciais para a sua integridade estrutural e funcionalidade, estando presentes nas membranas plasmática e externa, bem como na rede interna de membranas dos tilacoides, onde se localizam as cadeias de transferência de eletrões para os processos de fotossíntese e respiração. Estas membranas são caracterizadas por uma vasta diversidade de lípidos, compostos por quatro grupos: monogalactosil diacilglicerol (MGDG), digalactosil diacilglicerol (DGDG), sulfoquinovosil diacilglicerol (SQDG) e fosfatidilglicerol (PG), e um grupo de hidrocarbonetos. Os lípidos constituem um grupo diverso de moléculas orgânicas hidrofóbicas ou anfipáticas, que incluem os ácidos gordos (AGs) e os seus derivados. Os AGs são caracterizados pela presença de longas cadeias hidrocarbonadas e grupos carboxilo, componentes que são fundamentais e que contribuem para a estrutura e função de várias classes de lípidos. Os AGs representam então uma importante fonte de energia metabólica, que pode ser armazenada nas cianobactérias sob a forma de lípidos. As cianobactérias têm a capacidade de incorporar ácidos gordos livres exógenos (AGLEs) diretamente do ambiente, através da enzima acil-ACP sintetase (Aas). Uma vez ligados a uma holo-ACP, o tioéster acil-ACP torna-se um substrato para a via de biossíntese de lípidos, podendo ser alongado posteriormente. Os genes relacionados com a biossíntese de AGs (genes fab) nos genomas de cianobactérias são altamente conservados e mostram homologia significativa com os encontrados em Escherichia coli. No entanto, a via de degradação de AGs (ciclo de β-oxidação) nunca foi descrita em cianobactérias, e a presença de genes de degradação de AGs (genes fad) nesses organismos é desconhecida. Em E. coli, por exemplo, a degradação de AGLEs, e outros AGs livres são ativados pela FadD na forma de tioésteres de acil-CoA, posteriormente entrando no ciclo de β-oxidação. Este processo cíclico envolve quatro reações realizadas por três proteínas Fad. Inicia-se com uma primeira oxidação do acil-CoA pela acil-CoA desidrogenase (FadE), seguida de três reações catalisadas por um complexo tri-funcional (FadBA): uma hidratação e uma segunda oxidação pela 2-enoyl-CoA hidratase e 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase (FadB), e uma clivagem tiolítica final pela 3-cetoacil- CoA tiolase (FadA). Em cada ciclo de β-oxidação, um acil-CoA é encurtado em dois carbonos, libertando uma unidade de acetil-CoA, uma molécula chave que entra no ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs) para posterior produção de energia. Os lípidos das cianobactérias oferecem um valor biotecnológico imenso, impulsionando o seu uso como fábricas celulares microbianas sustentáveis em setores como a produção de biocombustíveis e bioplásticos, sublinhando a importância do seu estudo. Apesar da importância biotecnológica das cianobactérias, várias das suas vias metabólicas e genómicas permanecem pouco compreendidas, particularmente no que diz respeito ao seu metabolismo lipídico. Este estudo mostra, pela primeira vez, evidências bioinformáticas, bioquímicas e in vivo abrangentes que suportam a existência de uma via metabólica central nas cianobactérias, permitindo a descoberta de novas dimensões do seu potencial metabólico e estabelecendo uma nova base para futuros avanços biotecnológicos. A análise bioinformática realizada mostrou estirpes de cianobactérias que codificam uma maquinaria putativa de degradação de AGs (fad), homologa à presente em E. coli. É de notar a ausência do gene fadD praticamente nos genomas dessas cianobactérias. No entanto, através da análise do contexto genómico, um gene anteriormente não caracterizado, aqui denominado AMP-L, mostrou completar o conjunto de genes fad necessários para a via de β-oxidação nos genomas de cianobactérias, estando agrupado no mesmo cluster. Este gene, embora não homólogo do gene fadD, pertence à mesma superfamília de ligases dependentes de AMP. Dos 2876 genomas analisados, 157 continham o conjunto completo de genes fadB, fadA, fadE e AMP-L, incluindo a estirpe Cyanothece sp. PCC 7425 utilizada neste estudo. A estirpe Synechocystis sp. PCC 6803, utilizada também neste trabalho, não apresentou evidências da presença de genes putativos do processo de β-oxidação no seu genoma. Neste trabalho, também procurámos desvendar a função da proteína codificada pelo gene AMP-L de forma a caracterizar a sua função, que hipotetizamos ser homóloga à FadD. No entanto, futuros esforços devem concentrar-se na otimização da purificação da proteína AMP-L e na realização de ensaios enzimáticos adicionais para confirmar a atividade in vitro da acil-CoA ligase. Embora a deteção de intermediários de tioésteres de acil-CoA in vitro não tenha sido possível, esses intermediários foram identificados in vivo em culturas de Cyanothece sp. PCC 7425 e Synechocystis sp. PCC 6803, com comprimentos variáveis de cadeias de AGs, o que reforça a possível presença de um mecanismo de degradação de AGs. O protocolo otimizado neste estudo, permitiu a deteção de tioésteres de acil-CoA pela primeira vez em cianobactérias. Surpreendentemente, Synechocystis sp. PCC 6803, que não codifica os genes putativos de β-oxidação, apresentou resultados semelhantes aos da estirpe Cyanothece sp. PCC 7425. A presença de intermediários de acil-CoA em Synechocystis sp. PCC 6803 sugere que esta estirpe poderá ter uma via de degradação de AGs ainda não descoberta, ou outra rota metabólica que envolva intermediários de acil-CoA. Após experiências de suplementação com AGs marcados isotopicamente com carbono-13 (13C), verificou-se a presença de cadeias de AGs isotopicamente marcadas mais curtos nos lípidos membranares analisados em Cyanothece sp. PCC 7425 e Synechocystis sp. PCC 6803. No geral, este estudo representa uma ferramenta fundamental para avanços na área da bioengenharia, biotecnologia, abrindo novas possibilidades para aplicações inovadoras que aproveitem o potencial metabólico das cianobactérias.
Description
Keywords
Cyanobacteria Lipid metabolism Beta-oxidation Isotopic labeling Fad genes