Chemical communication in the Lusitanian toadfish, Halobatrachus didactylus

Gregório, Beatriz Neves

http://hdl.handle.net/10400.1/19704

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Tese de mestrado - Beatriz Neves Gregório.pdf		2.34 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Gregório, Beatriz Neves

Advisor(s)

Modesto, Teresa

Velez, Zélia

Hubbard, Peter

Abstract(s)

A comunicação química no ambiente aquático é extremamente importante em vários aspetos da fisiologia e comportamento dos peixes, como atrair parceiros, marcar território, coordenar processos reprodutivos, estabelecer hierarquias sociais, nas respostas de alarme e na definição de rotas de migração. Porém, a comunicação química, mediada pelo sistema olfativo, é ainda uma área pouco estudada da biologia dos peixes. A identidade dos compostos envolvidos e consequente efeitos fisiológicos e comportamentais apenas foram estabelecidos em algumas espécies, particularmente em peixes de água doce. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho é avaliar se a comunicação química está presente numa espécie de teleósteo marinho, o xarroco, Halobatrachus didactylus. Esta espécie apresenta características peculiares no comportamento reprodutivo que a tornam um excelente modelo para avaliar a importância da comunicação química, nomeadamente na reprodução. Durante a estação reprodutiva (maio-julho), os machos territoriais que guardam os ninhos (machos Tipo I) emitem vocalizações de corte para atrair as fêmeas e uma variedade de sons pulsados durante as interações agonísticas de defesa territorial com outros machos. Os machos menores (machos Tipo II) imitam as fêmeas morfologicamente e adotam um comportamento oportunista. As glândulas acessórias testiculares dos machos tipo I são maiores em comparação com as dos machos tipo II, sofrem um aumento significativo de tamanho durante a época reprodutiva e produzem diversos esteroides. Durante a época reprodutiva, as secreções produzidas por estas glândulas fluem abundantemente através do orifício urogenital dos machos tipo I. Assim, a hipótese subjacente a este trabalho é que, embora esta espécie utilize comunicação sonora em contexto reprodutivo, as substâncias libertadas pelas glândulas testiculares, ou outros fluidos orgânicos, possam também funcionar como sinais de status social/reprodutivo (ou seja, feromonas) e ter um papel importante na reprodução desta espécie. Neste contexto, os objetivos específicos deste trabalho são: (1) Caracterização morfológica do sistema olfativo; (2) Caracterização histológica do epitélio olfativo; (3) avaliação da sensibilidade olfativa a diferentes fluidos corporais provenientes de machos tipo I em diferentes estados reprodutivos, utilizando técnicas de eletrofisiologia; (4) Identificação química dos principais odorantes presentes nos fluidos olfativos mais potentes, através de técnicas de química analítica. O órgão olfativo foi caracterizado através do uso de técnicas morfológicas, histológicas e imunohistoquímicas. É constituído por duas narinas, uma única câmara olfativa tubular sem lamelas olfativas, com um padrão de distribuição contínuo do epitélio sensorial, e um único saco acessório. A narina anterior é tubular e alongada com um grupo de pequenas projeções digitiformes e a narina posterior é arredondada sem projeções. Os neurónios sensoriais são encontrados no fundo da câmara olfativa, como acontece em outras espécies de teleósteos. A sensibilidade olfativa a diversos fluidos corporais foi analisada por eletro-olfatograma (EOG). Os resultados mostram que fluidos corporais de conspecíficos, especificamente fluidos intestinais, biliares, das glândulas testiculares anteriores e posteriores são fontes de potentes odorantes para o xarroco. Os fluidos intestinais e da glândula testicular anterior de machos reprodutivos induzem uma resposta olfativa significativamente mais potente do que os dos machos não reprodutivos. Em contraste, a glândula testicular posterior evocou altas respostas olfativas, mas não mostrou diferenças significativas entre as épocas reprodutivas. Além dos fluidos glandulares, os fluidos intestinais e biliares foram os estímulos que evocaram as maiores amplitudes de resposta do EOG. Além disso, a diferença na potência do fluido intestinal de machos de diferentes épocas reprodutivas sugere que estes fluidos poderão transmitir informações sobre o estado reprodutivo do emissor. A extração em fase sólida de fluidos corporais através de colunas C18 mostrou que a maior parte da sensibilidade olfativa estava contida na fração de eluato (fase hidrofóbica), exceto para o fluido biliar. Posteriormente, o fracionamento do eluato dos fluidos intestinais por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) permitiu separar frações, cuja resposta olfativa foi testada por EOG. A cromatografia líquida com espectrometria de massas (LC-MS) às frações de HPLC que evocaram uma maior amplitude de resposta permitiu a identificação de alguns ácidos biliares, como o ácido cólico, ácido taurolitocólico e ácido tauroquenodesoxicólico. Esses resultados foram posteriormente confirmados por comparação de cromatogramas de massa e tempo de retenção com amostras padrão e reforçados por testes de adaptação cruzada em EOG que indicam a presença de ácido cólico no fluido intestinal. Os ácidos biliares identificados nos fluidos intestinais de animais de época reprodutiva são bons candidatos para explicar os efeitos da sensibilidade olfativa a esses fluidos. No entanto, as diferenças significativas encontradas nas respostas olfativas ao fluido da glândula testicular acessória anterior entre animais de época reprodutiva e não reprodutiva, podem indicar que estas glândulas também podem liberar odorantes importantes, além de outras funções na reprodução.Os resultados deste estudo sugerem fortemente que o xarroco poderá utilizar uma combinação de sinais químicos juntamente com sinais auditivos durante o processo reprodutivo, que poderão estar relacionados com as estratégias reprodutivas alternativas dos machos. Mais estudos são necessários para uma completa caracterização dos odorantes presentes nestes fluidos e para definir os seus efeitos fisiológicos e comportamentais em conspecíficos.

Aquatic animals use chemicals for communication for a variety of purposes including identification, sensing competitors and social status, detection of predators, and for reproduction. The highly vocal Lusitanian toadfish (Halobatrachus didactylus) is very well studied for acoustic communication. Moreover, an early study showed that the Lusitanian toadfish has olfactory sensitivity to conspecific body fluids. Does this species also use chemical communication through biological fluids that may act as signals of social or reproductive status? Detailed knowledge on chemical communication in marine fish is scarce; nevertheless, much evidence exists for its occurrence. This work aimed to characterize the morphology of the olfactory organ of toadfish, using histological and immunohistochemical approaches. The olfactory sensitivity to different body fluids – anterior and posterior testicular accessory gland, bile, and intestinal fluids – and possible differences in their potency is studied by electrophysiological techniques, and analytical chemistry was used to identify the main odorants in the most potent fluid. Olfactory sensitivity assessed by electro-olfactogram (EOG) indicated that conspecific intestinal and anterior testicular accessory gland fluids contain highly potent odorants, especially during the breeding season, suggesting that chemical communication is, indeed, important in toadfish reproduction. Solid-phase extraction of body fluids using C18 cartridges showed that most of olfactory sensitivity was contained in the eluate fraction, except for bile fluid. Further fractionation of eluate of intestinal fluids by high-performance liquid chromatography (HPLC) permitted isolate the most active compounds. Liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS) allowed the identification of some bile acids. Cross-adaptation experiments reinforced the presence of cholic acid in the intestinal fluid. These results are consistent with a role for chemical communication in the Lusitanian toadfish and suggest that bile acids might be involved.