Endocrine regulation of extracellular matrix proteins in calcified tissue in teleost fish

Estêvão, Dulce

http://hdl.handle.net/10400.1/416

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Authors

Estêvão, Dulce

Advisor(s)

Power, Deborah

Abstract(s)

A estrutura e a organização celular dos tecidos esqueléticos estão pouco estudadas nos teleósteos e o objectivo da presente tese consistiu na sua caracterização de forma a estudar como é que esses tecidos podem contribuir para a homeostase do cálcio. A morfologia da cartilagem e do osso observada usando técnicas histológicas gerais durante a formação do esqueleto em dourada (Sparus auratus) permitiu a caracterização dos tecidos e das transformações celulares que ocorrem durante a ossificação endocondral e dermal. Foram observados processos de ossificação alternativos em estruturas esqueléticas como os arcos branquiais, onde foram observados outros tecidos esqueléticos, diferentes da cartilagem e do osso. Uma característica dos peixes teleósteos é a presença de uma cobertura externa de escamas calcificadas. A sua morfologia foi descrita numa espécie marinha (dourada) e numa espécie eurihalina (tilápia, Oreochromis mossambicus). As escamas de S. auratus e O. mossambicus foram identificadas como escamas elasmóides e características deste tipo de escama como o foco, os circuli e os radii foram observadas em ambas as espécies. A matriz óssea desempenha, provavelmente, um papel fundamental na mobilização e na libertação de cálcio a partir dos tecidos esqueléticos e, por esse motivo, uma das principais proteínas da matriz óssea, a osteonectina (OSN), foi isolada e caracterizada a partir de um banco de tecido intervertebral de dourada. Foi demonstrado que o cDNA da OSN de dourada é homólogo ao de outras OSNs de vertebrados, e que a sequência de aminoácidos partilha estruturas idênticas à das moléculas equivalentes noutras espécies de vertebrados. Os resultados obtidos por RT-PCR e por ISH mostraram que o mRNA de OSN é mais abundante nos tecidos calcificados de dourada apesar de ocasionalmente ter sido detectado um sinal fraco em tecido moles. Durante a ontogenia, o mRNA de OSN foi detectado pela primeira vez no início da gastrulação e o perfil de expressão apresenta uma série de máximos e minímos durante o desenvolvimento larvar. A sua expressão foi detectada por hibridação in situ (ISH) em larvas a partir do 6º dia após eclosão e a localização e intensidade do sinal variaram com a idade. Elementos esqueléticos de origem endocondral e dermal expressam OSN e os resultados sugerem que a OSN pode desempenhar funções durante a condrogénese e a osteogénese. O mRNA da OSN é também muito abundante nas escamas de douradas e tilápias, juvenis e adultas, sugerindo que a OSN pode participar nas regulação da mineralização das escamas. O padrão de expressão de várias outras proteínas da matriz extracelular como, colagénio tipo I, cadeia a1 (Col1A1), colagénio tipo V, cadeia a2 (Col5A2), fibronectina (FN), fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRACP) e a proteína acídica, secretada pela cartilagem (ASPIC) foi estudado por ISH em escamas de dourada e de tilápia. O Col1A1 é muito abundante nas escamas de douradas e tilápias, quer juvenis, quer adultas. A TRACP também é expressa em escamas de juvenis e adultos de ambas as espécies embora em relativamente poucas células. O Col5A2 e a FN foram detectadas apenas em escamas de douradas e a ASPIC não é expressa em escamas de nenhuma das duas espécies. A ISH das proteínas da matriz extracelular nas escamas, em conjunto com métodos histológicos permitiu a identificação de células, supostamente osteoblastos e osteoclastos, na matriz das escamas indicando que este tecido é activamente metabolizado. Para estabelecer se as escamas podem contribuir, nos peixes, para o aumento dos níveis de cálcio associado ao estrogénio, foi estudada a presença de receptores de estrogénio (ER). A expressão das isoformas dos ER (a, b1 and b2) foi caracterizada por imunohistoquímica usando anticorpos policlonais específicos para dourada, em escamas de dourada e tilápia, juvenis e adultas. Os ER são expressos nas escamas de ambas as espécies nas células identificadas como osteoclastos embora a intensidade do sinal varie com a espécie e com a idade dos animais. Estes resultados sugerem que um dos mecanismos pelos quais o estrogénio pode influenciar a renovação das escamas consiste na ligação aos ER e na modulação da sua actividade. O modo como as hormonas actuam nos tecidos calcificados em peixe para promover a mobilização do cálcio não está estudado. O efeito da única hormona hipercalcémica identificada em peixe, a proteína relacionada com a hormona da paratiróide (PTHrP), na expressão do mRNA de OSN de dourada foi avaliado usando escamas num bio-ensaio in vitro. Os resultados mostraram que a PTHrP reduz a expressão de OSN em escamas de dourada e sugere que a acção da PTHrP no balanço de cálcio pode incluir a regulação de proteínas da matriz extracelular envolvidas na formação e mineralização da matriz do osso e/ou das escamas.