Spatio-temporal gene expression and evolutionary relationship of seabream betainehomocysteine S-methyltransferases

Fonseca, Luís Daniel Salsinha

http://hdl.handle.net/10400.1/10516

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Authors

Fonseca, Luís Daniel Salsinha

Advisor(s)

Fonseca, Maria Leonor Quintais Cancela da

Abstract(s)

O esqueleto é um órgão muito importante pois para além de funcionar como protecção de outros órgãos, suporta os músculos e serve como reservatório de minerais. Deste modo, as doenças ósseas e os mecanismos a elas associados foram desde sempre um importante objecto de estudos científicos. Embora a maioria destes estudos sejam feitos em mamíferos, nos últimos tempos, os peixes apareceram como bons modelos no estudo das doenças esqueléticas e dos seus mecanismos, uma vez que apresentam uma grande homologia em relação aos mamíferos, no que diz respeito a homeostasia, organização de sistemas, mecanismos moleculares, etc. Uma das ferramentas de peixe amplamente utilizadas pelo grupo de trabalho EDGE do CCMAR são as linhas celulares VSa13 e VSa16 derivadas de osso e com comprovada capacidade de mineralização in vitro (Pombinho et al 2004). Num estudo recente, com recurso a estas ferramentas, uma betaína homocisteína S-metiltransferase, foi identificada como uma enzima que poderá ter um papel importante na regulação do processo de mineralização dos tecidos ósseos de Sparus aurata. Como tal, este trabalho pretendeu caracterizar a família das proteínas BHMT em S. aurata e analisar a possível relação destas com os processos de mineralização. No decurso deste trabalho foram reconstruídos e validados5 isoformas de BHMT em S. aurata (BHMT1, -3, -4, -5, -6), e obtidos resultados que suportam a nossa hipótese inicial de um possível papel das BHMT na mineralização dos tecidos ósseos. A expressão dos 5 isoformas de BHMT reconstruidos foi analisada individualmente através de qPCR nas linhas celulares VSa13 e VSa16, bem como em tecidos adultos e durante estadios de desenvolvimento. Nos qPCRs realizados nas linhas celulares VSa13 e VSa16, tanto a BHMT4 como a BHMT5 não foram detectadas. A BHMT1, embora expressa, não apresentou regulação aquando do processo de mineralização. Por sua vez, a expressão da BHMT3 exibe uma regulação negativa com valores 246x e 168x menores, em VSa13 e VSa16 respectivamente, em relação ao controlo. A BHMT6 apresenta um padrão semelhante à BHMT3, sendo também regulada negativamente embora de uma forma menos severa, apresentando valores 2x e 27x menores, nas VSa13 e VSa16 respectivamente, relativamente ao controlo. Nos tecidos, as BHMT1, 4, 5 e 6 foram mais expressas nos tecidos moles (ex.: fígado, rim e intestino), enquanto a BHMT3 foi mais expressa em tecidos mineralizados (ex.: vertebra e cartilagem). Durante o desenvolvimento, a expressão da BHMT1 é mais acentuada na fase final do desenvolvimento (130 dias após a eclosão (dae)). Por sua vez, os padrões de expressão da BHMT4 e 5 são muito similares, com um pico aos 5 dae, seguido por um incremento da expressão a partir do início da metamorfose. Na BHMT3, para além de se registar um aumento da expressão na fase final do desenvolvimento (130 dae), é de salientar uma expressão significativa aquando da fase de início da mineralização até ao final da fase larvar. No que respeita à expressão da BHMT6 os resultados parecem indicar uma importância desta proteína nas fases de transição, com aumentos da expressão a acontecerem após a eclosão (5 dae), no início da metamorfose (37 dae) e na mudança entre a fase larvar e a fase de juvenil (70 dae). Um total de 76 sequências de BHMT foram reconstruidas (33 das quais completas ou quase completas) provenientes de diferentes grupos (anfíbios, peixes ósseos, peixes cartilagíneos, sauropsídeos e agnatas). As 33 sequências completas (mais 6 recuperadas directamente do GenBank), foram utilizadas na construção da árvore filogenética, onde se constatou que a maioria das sequencias pertence ao sub-grupo similar à HsaBHMT1, o que pode indicar uma maior abundância na expressão destes genes. Estes resultados mostram ainda uma relação de proximidade entre a HsaBHMT1 e as BHMT1; BHMT3 e BHMT6 e entre a HsaBHMT2 e as BHMT4 e BHMT5. A descoberta de que a HsaBHMT2 perdeu a afinidade para a betaína não invalida este resultado, uma vez que esta característica poderá ter sido perdida posteriormente. A análise filogenética também não indicou a possível existência de isoformas adicionais de BHMT em Sparus aurata. Em conclusão, os resultados deste trabalho parecem promissores, no que respeita a uma possível influência das BHMT, mais concretamente da BHMT3 e da BHMT6, na regulação da actividade de mineralização nos tecidos ósseos.