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Publication
Studies towards unveiling the association of Gla-rich protein with osteoarthritis
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Osteoarthritis (OA) is a whole-joint disease believed to onset after articular cartilage
damage and accompanied by tissue inflammation, abnormal bone formation and extracellular
matrix (ECM) mineralization. Gla-rich protein (GRP), the latest discovered vitamin Kdependent
protein (VKDP), was shown to accumulate in mouse and sturgeon cartilage, and
sites of skin and vascular calcification in human. Therefore, we investigated the possible
involvement of GRP with OA development. An osteoarthritic and control samples human
biobank was collected and used for the comparative analysis of GRP patterning at
transcriptional and translational levels. Two novel GRP alternative spliced transcripts were
unveiled in human (GRP-F5 and F6), yet GRP-F1, corresponding to the full-length protein,
was shown to be the predominant variant in articular tissues and upregulated in osteoarthritic
cartilage. Undercarboxylated GRP was the prevalent protein form found associated with
osteoarthritic cartilage and synovial membrane tissues, highly accumulated at sites of
calcification, indicating that the impairment of VKDPs -carboxylation may be related with
OA. Using a chondrocyte and synoviocyte cell system developed within this project, we
further investigated the association of GRP with OA mineralization and inflammatory
processes. Upregulation of GRP was found during induced mineralization and inflammation,
and associated to cell differentiation towards ECM mineralization and inflammatory
responses, in both cellular types. Moreover, the role of GRP was highlighted through
functional assays, showing the inhibition of ECM mineralization and decreased inflammatory
response following GRP supplementation. While -carboxylation was required for GRP antimineralization
function, its anti-inflammatory effect was independent of protein -
carboxylation status. Ultimately, using serum samples from our biobank and a comparative
proteomic approach, candidate OA biomarkers were identified. Overall, our results
demonstrated, for the first time, the involvement of GRP in two of the main pathological
processes occurring in OA, contributing for new knowledge regarding disease progression.
A osteoartrite (OA) representa a forma mais comum de doenças degenerativas das articulações, sendo a principal causa de incapacidade física crónica na população acima dos 50 anos de idade. A origem da OA está geralmente associada a danos na cartilagem articular, acompanhados por uma remodelação da matriz extracelular (ECM), que numa sucessão de eventos acabam por comprometer toda a articulação. A perda de cartilagem articular, inflamação tecidular, formação óssea anormal e a mineralização da ECM, são características comuns desta patologia. No entanto, o conhecimento sobre mecanismos moleculares da OA ainda é limitado, o seu diagnóstico é tardio e não existem atualmente medicamentos eficazes para o tratamento da doença. É portanto essencial a descoberta de novos alvos moleculares e biomarcadores que beneficiem a patologia. A proteína rica em Glas (GRP), último membro descoberto pertencente à família de proteínas dependentes da vitamina K (VKDPs), representa um potencial alvo para o estudo de mecanismos da OA. Esta proteína é bastante acumulada na cartilagem de ratinho e esturjão, e em zonas calcificadas na pele e sistema cardiovascular em humano. Além disso, a GRP é considerada um regulador negativo da osteogénse. Partículas de calciproteínas (CPP) presentes em circulação em fluidos biológicos, representam igualmente um alvo para o estudo de processos moleculares da OA uma vez que estas também são associadas a situações de calcificação patológica e mesmo a processos inflamatórios. Neste âmbito, o principal objetivo do presente estudo foi a análise da possível associação entre a GRP e o desenvolvimento da osteoartrite. Um objetivo adicional foi a procura de biomarcadores para a patologia, com especial interesse na GRP. Durante o decorrer deste projeto, foi coletado um biobanco bem caracterizado contendo tecidos e fluidos biológicos de pacientes com osteoartrite do joelho e indivíduos sem histórico de patologias nas articulações. As amostras deste banco biológico foram utilizadas para a realização de análises comparativas de padrões de expressão e acumulação da GRP. Haviam sido anteriormente identificadas em ratinho e esturjão quatro variantes por splicing alternativo do gene da GRP, nomeadamente a GRP-F1, F2, F3, e F4. Aqui, utilizando uma estratégia de RT-PCR, foram identificados em humano dois novos transcritos da GRP, denominadas GRP-F5 e F6 e caracterizados pela perda de domínios de -carboxilação e secreção. No entanto, os nossos resultados evidenciaram a variante GRP-F1, correspondente à proteína total, como a maioritariamente expressa em cartilagem e membrana sinovial, sugerindo que associações existentes entre a GRP e a OA reflitam sobretudo a contribuição deste transcrito. Além disso, também se verificou que a GRP-F1 era sobrexpressa em cartilagem osteoartrítica em comparação com tecidos controlo. O estudo entre a possível associação da GRP com a OA prosseguiu utilizando técnicas imunológicas e anticorpos conformacionais específicos contra as formas carboxilada (cGRP) e subcarboxilada (ucGRP) da GRP. Esta abordagem revelou que embora ambas as entidades sejam acumuladas em tecidos articulares e fluidos osteoartríticos, bem como zonas de calcificação ectópica, a ucGRP é a forma predominante associada à cartilagem e membrana sinovial osteoartríticas, enquanto que a cGRP é preferencialmente acumulada nos mesmos tecidos em condições controlo. A forma subcarboxilada da proteína Gla da matriz (ucMGP) foi também a predominantemente associada à cartilagem osteoartrítica. A combinação destes resultados sugere que deficiências na -carboxilação de VKDPs estejam possivelmente relacionadas com mecanismos moleculares da OA. Os nossos resultados imunohistológicos também revelaram que a acumulação de GRP em membranas sinoviais osteoartríticas não era restrita a zonas de calcificação, ocorrendo também nas camadas que revestem estes tecidos e sugerindo associações a outros processos. Utilizando um sistema celular de linhas primárias de condrócitos e sinoviócitos desenvolvido no âmbito deste projeto, o estudo da associação entre a GRP e a mineralização associada à OA foi aprofundado, bem como o seu possível envolvimento com processos inflamatórios. A análise comparativas do padrão de expressão de GRP entre células osteoartríticas e controlo, revelou que esta era sobrexpressa em células osteoartríticas, em concordância com os resultados obtidos in vivo com amostras de cartilagem. Também se verificou que a GRP era sobrexpressa mediante a indução de mineralização e inflamação do sistema, e associada a processos de diferenciação celular inerentes à mineralização da ECM e respostas inflamatórias, em ambos os tipos celulares. Notavelmente, foram evidenciadas funções biológicas da GRP na OA através de estudos funcionais: a sua capacidade de inibição da mineralização da ECM e a diminuição de respostas inflamatórias após suplementação da proteína. Curiosamente, a -carboxilação da GRP revelou ser essencial para a sua função anti-calcificante enquanto que o efeito antiinflamatório observado mediado pela GRP ou GRP-acoplada a cristais de fosfato de cálcio básico foi independente do seu estado de -carboxilação, evidenciando funções alternativas para a ucGRP em particular. Os nossos novos resultados sugerem que na OA ocorra um aumento da expressão de VKDPs, como a GRP e MGP, possivelmente associado ao combate de processos de calcificação ectópica. No entanto, a sobrecarga do sistema pode resultar numa capacidade de -carboxilação deficiente, culminando na prevalência de ucGRP e ucMGP. Por sua vez, a ucGRP pode estar associada ao controlo de níveis de mediadores de inflamação através de mecanismos ainda desconhecidos. A última parte deste trabalho pretendia identificar candidatos a biomarcadores da OA, para fins de diagnóstico da patologia ou de monitorização de tratamentos, sendo de particular interesse a análise do potencial da GRP como um destes biomarcadores. Contudo, o uso da técnica clássica de electroforese bidimensional revelou ser inadequado para o estudo desta proteína. Em alternativa, utilizando a mesma abordagem proteómica e amostras de soro do biobanco colecatdo, foi realizada a procura de potenciais biomarcadores para a patologia associados a CPP. Esta análise permitiu a identificação de 19 proteínas diferencialmente expressas entre condições controlo e osteoartríticas, que podem ser consideradas potenciais biomarcadores para a OA. Além disso, algumas das proteínas identificadas associadas a estes complexos estão relacionadas com processos de calcificação patológica e inflamatórios, o que sugere um possível envolvimento entre CPP e osteoartrite. Os nossos resultados abrem novas portas no domínio de investigação científica da osteoartrite, sobretudo através da associação nunca antes descrita entre a GRP e a patologia. Os dados coletados durante o projeto revelaram o envolvimento da GRP, aparentemente com efeitos benéficos, em dois dos principais processos patológicos que ocorrem na OA, nomeadamente a calcificação patológica e inflamação, o que contribuiu para um melhor conhecimento relativo à progressão da patologia.
A osteoartrite (OA) representa a forma mais comum de doenças degenerativas das articulações, sendo a principal causa de incapacidade física crónica na população acima dos 50 anos de idade. A origem da OA está geralmente associada a danos na cartilagem articular, acompanhados por uma remodelação da matriz extracelular (ECM), que numa sucessão de eventos acabam por comprometer toda a articulação. A perda de cartilagem articular, inflamação tecidular, formação óssea anormal e a mineralização da ECM, são características comuns desta patologia. No entanto, o conhecimento sobre mecanismos moleculares da OA ainda é limitado, o seu diagnóstico é tardio e não existem atualmente medicamentos eficazes para o tratamento da doença. É portanto essencial a descoberta de novos alvos moleculares e biomarcadores que beneficiem a patologia. A proteína rica em Glas (GRP), último membro descoberto pertencente à família de proteínas dependentes da vitamina K (VKDPs), representa um potencial alvo para o estudo de mecanismos da OA. Esta proteína é bastante acumulada na cartilagem de ratinho e esturjão, e em zonas calcificadas na pele e sistema cardiovascular em humano. Além disso, a GRP é considerada um regulador negativo da osteogénse. Partículas de calciproteínas (CPP) presentes em circulação em fluidos biológicos, representam igualmente um alvo para o estudo de processos moleculares da OA uma vez que estas também são associadas a situações de calcificação patológica e mesmo a processos inflamatórios. Neste âmbito, o principal objetivo do presente estudo foi a análise da possível associação entre a GRP e o desenvolvimento da osteoartrite. Um objetivo adicional foi a procura de biomarcadores para a patologia, com especial interesse na GRP. Durante o decorrer deste projeto, foi coletado um biobanco bem caracterizado contendo tecidos e fluidos biológicos de pacientes com osteoartrite do joelho e indivíduos sem histórico de patologias nas articulações. As amostras deste banco biológico foram utilizadas para a realização de análises comparativas de padrões de expressão e acumulação da GRP. Haviam sido anteriormente identificadas em ratinho e esturjão quatro variantes por splicing alternativo do gene da GRP, nomeadamente a GRP-F1, F2, F3, e F4. Aqui, utilizando uma estratégia de RT-PCR, foram identificados em humano dois novos transcritos da GRP, denominadas GRP-F5 e F6 e caracterizados pela perda de domínios de -carboxilação e secreção. No entanto, os nossos resultados evidenciaram a variante GRP-F1, correspondente à proteína total, como a maioritariamente expressa em cartilagem e membrana sinovial, sugerindo que associações existentes entre a GRP e a OA reflitam sobretudo a contribuição deste transcrito. Além disso, também se verificou que a GRP-F1 era sobrexpressa em cartilagem osteoartrítica em comparação com tecidos controlo. O estudo entre a possível associação da GRP com a OA prosseguiu utilizando técnicas imunológicas e anticorpos conformacionais específicos contra as formas carboxilada (cGRP) e subcarboxilada (ucGRP) da GRP. Esta abordagem revelou que embora ambas as entidades sejam acumuladas em tecidos articulares e fluidos osteoartríticos, bem como zonas de calcificação ectópica, a ucGRP é a forma predominante associada à cartilagem e membrana sinovial osteoartríticas, enquanto que a cGRP é preferencialmente acumulada nos mesmos tecidos em condições controlo. A forma subcarboxilada da proteína Gla da matriz (ucMGP) foi também a predominantemente associada à cartilagem osteoartrítica. A combinação destes resultados sugere que deficiências na -carboxilação de VKDPs estejam possivelmente relacionadas com mecanismos moleculares da OA. Os nossos resultados imunohistológicos também revelaram que a acumulação de GRP em membranas sinoviais osteoartríticas não era restrita a zonas de calcificação, ocorrendo também nas camadas que revestem estes tecidos e sugerindo associações a outros processos. Utilizando um sistema celular de linhas primárias de condrócitos e sinoviócitos desenvolvido no âmbito deste projeto, o estudo da associação entre a GRP e a mineralização associada à OA foi aprofundado, bem como o seu possível envolvimento com processos inflamatórios. A análise comparativas do padrão de expressão de GRP entre células osteoartríticas e controlo, revelou que esta era sobrexpressa em células osteoartríticas, em concordância com os resultados obtidos in vivo com amostras de cartilagem. Também se verificou que a GRP era sobrexpressa mediante a indução de mineralização e inflamação do sistema, e associada a processos de diferenciação celular inerentes à mineralização da ECM e respostas inflamatórias, em ambos os tipos celulares. Notavelmente, foram evidenciadas funções biológicas da GRP na OA através de estudos funcionais: a sua capacidade de inibição da mineralização da ECM e a diminuição de respostas inflamatórias após suplementação da proteína. Curiosamente, a -carboxilação da GRP revelou ser essencial para a sua função anti-calcificante enquanto que o efeito antiinflamatório observado mediado pela GRP ou GRP-acoplada a cristais de fosfato de cálcio básico foi independente do seu estado de -carboxilação, evidenciando funções alternativas para a ucGRP em particular. Os nossos novos resultados sugerem que na OA ocorra um aumento da expressão de VKDPs, como a GRP e MGP, possivelmente associado ao combate de processos de calcificação ectópica. No entanto, a sobrecarga do sistema pode resultar numa capacidade de -carboxilação deficiente, culminando na prevalência de ucGRP e ucMGP. Por sua vez, a ucGRP pode estar associada ao controlo de níveis de mediadores de inflamação através de mecanismos ainda desconhecidos. A última parte deste trabalho pretendia identificar candidatos a biomarcadores da OA, para fins de diagnóstico da patologia ou de monitorização de tratamentos, sendo de particular interesse a análise do potencial da GRP como um destes biomarcadores. Contudo, o uso da técnica clássica de electroforese bidimensional revelou ser inadequado para o estudo desta proteína. Em alternativa, utilizando a mesma abordagem proteómica e amostras de soro do biobanco colecatdo, foi realizada a procura de potenciais biomarcadores para a patologia associados a CPP. Esta análise permitiu a identificação de 19 proteínas diferencialmente expressas entre condições controlo e osteoartríticas, que podem ser consideradas potenciais biomarcadores para a OA. Além disso, algumas das proteínas identificadas associadas a estes complexos estão relacionadas com processos de calcificação patológica e inflamatórios, o que sugere um possível envolvimento entre CPP e osteoartrite. Os nossos resultados abrem novas portas no domínio de investigação científica da osteoartrite, sobretudo através da associação nunca antes descrita entre a GRP e a patologia. Os dados coletados durante o projeto revelaram o envolvimento da GRP, aparentemente com efeitos benéficos, em dois dos principais processos patológicos que ocorrem na OA, nomeadamente a calcificação patológica e inflamação, o que contribuiu para um melhor conhecimento relativo à progressão da patologia.
Description
Keywords
Gla-rich protein (GRP) Osteoarthritis (OA) Ectopic calcification inhibitor Antiinflammatory