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Publication
Development of novel antitubercular agents: design, synthesis, in vitro evaluation and in silico studies
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Authors
Abstract(s)
Tuberculosis remains a significant global health threat, with millions of new cases and deaths reported annually. The emergence and spread of drug-resistant TB strains pose a major challenge, highlighting the critical need for novel antitubercular agents. This doctoral program investigated the potential of three promising heterocyclic compound classes for their antitubercular activity: fluoroquinolones, benzothiazinones, and pyrazolopyrimidines.
A series of delafloxacin analogues substituted at the C-7 position were synthesised and evaluated for their antimycobacterial activity. The synthetic approach to the compounds was optimised, emphasising the relevance of a careful selection of cyclic amines for substitution at the C-7 position. Biological assays identified a hit compound, AS-2-13, with exceptional activity (IC50 = 0.041 μM). In silico docking studies suggested common interactions between most analogs and the gyrase target, with some compounds exhibiting additional interactions with DNA chains or hydrophobic interactions with protein residues.
This study also explored benzothiazinones that could target DprE1 non-covalently, a critical protein in Mycobacterium tuberculosis. We synthesised nine new analogues and evaluated their activity. While promising, the non-covalent compounds displayed significantly lower activity than their covalent counterparts. Molecular modelling studies suggest a distinct binding orientation within the DprE1 active site for the non-covalent series, potentially hindering interaction with crucial residues and explaining the reduced activity.
Lastly, we investigated pyrazolo[1,5-a]pyrimidines as potential candidates for anti-tuberculosis therapy. A common synthetic method utilises 3-aminopyrazole, but tautomerism can complicate the reaction. To address this challenge, we examined the factors influencing tautomerism in 3(5)-aminopyrazole with the goal of developing methods for selective synthesis. Subsequently, employing a combination of experimental and theoretical techniques, the structure and stability of 3-aminopyrazole and 5-aminopyrazole tautomers was analysed, revealing that 3-aminopyrazole is the most stable form and dominates in cryogenic inert matrices. Investigation of the photochemical properties of 3-aminopyrazole revealed its conversion to 5-aminopyrazole under ultraviolet irradiation.
A tuberculose (TB) permanece um grave problema de saúde pública, com milhões de novos casos, e mortes, em cada ano. O desenvolvimento de novos agentes antituberculosos é crucial para combater a resistência crescente aos medicamentos existentes. A síntese de compostos heterocíclicos com propriedades biológicas promissoras é uma área de investigação ativa em Química Medicinal, constituindo um dos principais ramos explorados para o desenvolvimento de novos fármacos destinados ao tratamento da tuberculose, tendo como objetivo último a sua erradicação. No âmbito deste programa doutoral foram exploradas três classes de compostos heterocíclicos, nomeadamente, fluoroquinolonas, benzotiazinonas e pirazolopirimidinas, com o objetivo de desenvolver novos análogos enquanto potenciais candidatos para o tratamento da tuberculose. As fluoroquinolonas são uma das classes farmacológicas mais antigas direcionadas ao tratamento da tuberculose e continuam a representar uma das classes mais bem-sucedidas na terapêutica da TB, fazendo parte das opções de primeira e segunda linha, segundo as diretivas da Organização Mundial da Saúde. De entre as fluoroquinolonas mais recentes, a delafloxacina representa um líder de série devido às suas características únicas, que resultam em potência excecional na inibição de diversas estirpes de bactérias Gram positivas e Gram negativas, incluindo a Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Embora a delafloxacina não tenha sido aprovada para o tratamento da TB, o seu caráter de ácido fraco resulta numa estrutura carregada negativamente a pH neutro, porém neutra a pH ácido. Esta propriedade da molécula revela um excelente potencial para a sua acumulação em locais caracterizados por um pH ácido, bem como para penetrar para o interior das células, o que não é tão favorável nas restantes fluoroquinolonas devido ao seu caráter anfotérico e presença de estruturas iónicas. Assim, neste âmbito, explorou-se a síntese de uma série de análogos da delafloxacina substituídos na posição C-7 para avaliar a sua atividade biológica contra bactérias M. tuberculosis (Mtb). O trabalho resultou num método otimizado e eficiente para a síntese desses compostos, destacando considerações estruturais importantes para futuras sínteses de análogos de delafloxacina, nomeadamente a importância da seleção cuidadosa de aminas cíclicas para substituição na posição C-7. Esta abordagem seletiva é essencial, não só para efeitos de atividade biológica, mas também para garantir melhores resultados na síntese através de reações de substituição nucleofílica aromática. Deste trabalho resultou a síntese de dezasseis novas fluoroquinolonas que foram submetidas a estudos biológicos através de ensaios in vitro contra estirpes Mtb H37Rv (whole-cell) e ensaios de inibição da girase, e complementados por estudos computacionais de modelação molecular para determinação da sua atividade terapêutica, assim como dos modos de interação com o alvo terapêutico, respetivamente. Os ensaios biológicos permitiram a identificação de um composto hit, AS-2-13, o que exibiu a atividade mais elevada (IC50 = 0,041 μM), e a avaliação dos perfis farmacocinéticos revelou resultados excelentes para a generalidade dos novos análogos. O estudo de docking posterior indicou interações comuns entre a maioria dos análogos e a girase, salientado certas particularidades em alguns compostos, tais como ligações adicionais com cadeias de DNA e/ou interações hidrofóbicas com os resíduos proteicos, que podem estar associadas à variabilidade nos níveis de inibição observada. Neste programa doutoral explorou-se também a síntese de benzotiazinonas (BTZ) como potenciais agentes antituberculosos. As benzotiazinonas inibem a proteína DprE1, essencial para a síntese da membrana celular do Mycobacterium tuberculosis. Segundo um estudo recente publicado na literatura, a substituição com um grupo cloro na posição 8 resultou em inibição da enzima através de um mecanismo não-covalente, com potência excecional, a concentrações na gama nanomolar (MIC = 0.003 μM). Adicionalmente, estudos de relação estrutura-atividade indicam que os substituintes da cadeia lateral, em C-2, exercem um número reduzido de contactos com o sítio ativo, pelo que a funcionalização nesta posição constitui uma estratégia promissora para a introdução de variabilidade nas moléculas e potencial promoção do estabelecimento de novas interações e ajuste de propriedades farmacocinéticas. Assim, foram sintetizadas nove novas benzotiazinonas (BTZ) para inibição não-covalente de DprE1, com substituições nas posições 8 e 2 do anel BTZ, e a sua atividade foi avaliada através de ensaios in vitro. Contudo, contrariamente ao esperado, todos os compostos analisados apresentaram atividade inibitória significativamente reduzida em comparação com a exibida pelas benzotiazinonas covalentes. Para elucidar as razões da diferença de atividade foram realizados estudos de modelação molecular. Os resultados revelaram que as novas benzotiazinonas não covalentes adotam uma posição diferente no sítio ativo da DprE1, comparativamente com as benzotiazinonas covalentes. Essa mudança de posição tem impacto na eficácia da interação com a cavidade do sítio ativo, explicando a perda de atividade inibitória. Por fim, neste estudo foi explorado o desenho e síntese de alvos do tipo pirazolo[1,5-a]pirimidina como potenciais candidatos à terapêutica anti-TB. Uma das abordagens comuns para a obtenção da estrutura pirazolo[1,5-a]pirimidina baseia-se na reação de ciclocondensação entre o reagente comercial 3-aminopirazol e diversos agentes bifuncionais. Porém, acredita-se que a formação do produto de condensação ocorre através da ciclização do tautómero 5-aminopirazol. A tautomeria representa um desafio significativo para a síntese orgânica devido a possíveis alterações estruturais nos reagentes e/ou à coexistência de múltiplas espécies no mesmo meio, comprometendo fatores como a reatividade, a regio- e quimiosselectividade, a caracterização estrutural e o rendimento, entre outros. Assim, este trabalho analisou os fatores que influenciam a tautomeria na classe dos pirazóis, com destaque no 3(5)-aminopirazol, tendo por objetivo a identificação de metodologias eficazes para a síntese seletiva de pirazolo[1,5-a]pirimidinas a partir da espécie tautomérica 3(5)-aminopirazol. Posteriormente investigou-se a estrutura e reatividade do composto 3(5)-aminopirazol através de técnicas experimentais de isolamento em matriz criogénica acoplado a espetroscopia de infravermelho, combinadas com cálculos teóricos ao nível de teoria DFT(B3LYP)/6-311++G(d,p). Neste estudo, o composto 3-aminopirazol foi depositado em matrizes de árgon e xénon, revelando a presença de ambos os tautómeros (3-aminopirazol e 5-aminopirazol) nas matrizes criogénicas, com dominância significativa da espécie 3-aminopirazol. A coexistência de ambas as espécies tautoméricas nas matrizes de gases nobres é sugestiva de transferências intermoleculares de protão, prévias à deposição da mistura resultante. A investigação aprofundada das propriedades estruturais de cada tautómero revelou que a estabilidade relativa dos tautómeros 3-aminopirazol (3AP) e 5-aminopirazol (5AP) resulta de contribuições partilhadas resultantes de interações eletrónicas e de repulsões eletrostáticas. Revelou também que o 3-aminopirazol é energeticamente mais estável do que o 5-aminopirazol, com uma diferença energética de 10.7 kJ mol−1. Neste estudo foi também estudado o comportamento fotoquímico do composto tautomérico. Para tal, o composto isolado em matriz de árgon foi submetido a irradiação ultravioleta (UV) utilizando uma lâmpada de banda larga. O principal resultado observado foi a fototautomerização do composto mais estável 3AP para a forma 5AP, provavelmente por um mecanismo intramolecular. No âmbito deste programa de doutoramento foram também realizados trabalhos adicionais que, embora não examinados em detalhes nesta tese, resultaram em publicações científicas citadas e contribuíram para a formação científica da autora desta tese.
A tuberculose (TB) permanece um grave problema de saúde pública, com milhões de novos casos, e mortes, em cada ano. O desenvolvimento de novos agentes antituberculosos é crucial para combater a resistência crescente aos medicamentos existentes. A síntese de compostos heterocíclicos com propriedades biológicas promissoras é uma área de investigação ativa em Química Medicinal, constituindo um dos principais ramos explorados para o desenvolvimento de novos fármacos destinados ao tratamento da tuberculose, tendo como objetivo último a sua erradicação. No âmbito deste programa doutoral foram exploradas três classes de compostos heterocíclicos, nomeadamente, fluoroquinolonas, benzotiazinonas e pirazolopirimidinas, com o objetivo de desenvolver novos análogos enquanto potenciais candidatos para o tratamento da tuberculose. As fluoroquinolonas são uma das classes farmacológicas mais antigas direcionadas ao tratamento da tuberculose e continuam a representar uma das classes mais bem-sucedidas na terapêutica da TB, fazendo parte das opções de primeira e segunda linha, segundo as diretivas da Organização Mundial da Saúde. De entre as fluoroquinolonas mais recentes, a delafloxacina representa um líder de série devido às suas características únicas, que resultam em potência excecional na inibição de diversas estirpes de bactérias Gram positivas e Gram negativas, incluindo a Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Embora a delafloxacina não tenha sido aprovada para o tratamento da TB, o seu caráter de ácido fraco resulta numa estrutura carregada negativamente a pH neutro, porém neutra a pH ácido. Esta propriedade da molécula revela um excelente potencial para a sua acumulação em locais caracterizados por um pH ácido, bem como para penetrar para o interior das células, o que não é tão favorável nas restantes fluoroquinolonas devido ao seu caráter anfotérico e presença de estruturas iónicas. Assim, neste âmbito, explorou-se a síntese de uma série de análogos da delafloxacina substituídos na posição C-7 para avaliar a sua atividade biológica contra bactérias M. tuberculosis (Mtb). O trabalho resultou num método otimizado e eficiente para a síntese desses compostos, destacando considerações estruturais importantes para futuras sínteses de análogos de delafloxacina, nomeadamente a importância da seleção cuidadosa de aminas cíclicas para substituição na posição C-7. Esta abordagem seletiva é essencial, não só para efeitos de atividade biológica, mas também para garantir melhores resultados na síntese através de reações de substituição nucleofílica aromática. Deste trabalho resultou a síntese de dezasseis novas fluoroquinolonas que foram submetidas a estudos biológicos através de ensaios in vitro contra estirpes Mtb H37Rv (whole-cell) e ensaios de inibição da girase, e complementados por estudos computacionais de modelação molecular para determinação da sua atividade terapêutica, assim como dos modos de interação com o alvo terapêutico, respetivamente. Os ensaios biológicos permitiram a identificação de um composto hit, AS-2-13, o que exibiu a atividade mais elevada (IC50 = 0,041 μM), e a avaliação dos perfis farmacocinéticos revelou resultados excelentes para a generalidade dos novos análogos. O estudo de docking posterior indicou interações comuns entre a maioria dos análogos e a girase, salientado certas particularidades em alguns compostos, tais como ligações adicionais com cadeias de DNA e/ou interações hidrofóbicas com os resíduos proteicos, que podem estar associadas à variabilidade nos níveis de inibição observada. Neste programa doutoral explorou-se também a síntese de benzotiazinonas (BTZ) como potenciais agentes antituberculosos. As benzotiazinonas inibem a proteína DprE1, essencial para a síntese da membrana celular do Mycobacterium tuberculosis. Segundo um estudo recente publicado na literatura, a substituição com um grupo cloro na posição 8 resultou em inibição da enzima através de um mecanismo não-covalente, com potência excecional, a concentrações na gama nanomolar (MIC = 0.003 μM). Adicionalmente, estudos de relação estrutura-atividade indicam que os substituintes da cadeia lateral, em C-2, exercem um número reduzido de contactos com o sítio ativo, pelo que a funcionalização nesta posição constitui uma estratégia promissora para a introdução de variabilidade nas moléculas e potencial promoção do estabelecimento de novas interações e ajuste de propriedades farmacocinéticas. Assim, foram sintetizadas nove novas benzotiazinonas (BTZ) para inibição não-covalente de DprE1, com substituições nas posições 8 e 2 do anel BTZ, e a sua atividade foi avaliada através de ensaios in vitro. Contudo, contrariamente ao esperado, todos os compostos analisados apresentaram atividade inibitória significativamente reduzida em comparação com a exibida pelas benzotiazinonas covalentes. Para elucidar as razões da diferença de atividade foram realizados estudos de modelação molecular. Os resultados revelaram que as novas benzotiazinonas não covalentes adotam uma posição diferente no sítio ativo da DprE1, comparativamente com as benzotiazinonas covalentes. Essa mudança de posição tem impacto na eficácia da interação com a cavidade do sítio ativo, explicando a perda de atividade inibitória. Por fim, neste estudo foi explorado o desenho e síntese de alvos do tipo pirazolo[1,5-a]pirimidina como potenciais candidatos à terapêutica anti-TB. Uma das abordagens comuns para a obtenção da estrutura pirazolo[1,5-a]pirimidina baseia-se na reação de ciclocondensação entre o reagente comercial 3-aminopirazol e diversos agentes bifuncionais. Porém, acredita-se que a formação do produto de condensação ocorre através da ciclização do tautómero 5-aminopirazol. A tautomeria representa um desafio significativo para a síntese orgânica devido a possíveis alterações estruturais nos reagentes e/ou à coexistência de múltiplas espécies no mesmo meio, comprometendo fatores como a reatividade, a regio- e quimiosselectividade, a caracterização estrutural e o rendimento, entre outros. Assim, este trabalho analisou os fatores que influenciam a tautomeria na classe dos pirazóis, com destaque no 3(5)-aminopirazol, tendo por objetivo a identificação de metodologias eficazes para a síntese seletiva de pirazolo[1,5-a]pirimidinas a partir da espécie tautomérica 3(5)-aminopirazol. Posteriormente investigou-se a estrutura e reatividade do composto 3(5)-aminopirazol através de técnicas experimentais de isolamento em matriz criogénica acoplado a espetroscopia de infravermelho, combinadas com cálculos teóricos ao nível de teoria DFT(B3LYP)/6-311++G(d,p). Neste estudo, o composto 3-aminopirazol foi depositado em matrizes de árgon e xénon, revelando a presença de ambos os tautómeros (3-aminopirazol e 5-aminopirazol) nas matrizes criogénicas, com dominância significativa da espécie 3-aminopirazol. A coexistência de ambas as espécies tautoméricas nas matrizes de gases nobres é sugestiva de transferências intermoleculares de protão, prévias à deposição da mistura resultante. A investigação aprofundada das propriedades estruturais de cada tautómero revelou que a estabilidade relativa dos tautómeros 3-aminopirazol (3AP) e 5-aminopirazol (5AP) resulta de contribuições partilhadas resultantes de interações eletrónicas e de repulsões eletrostáticas. Revelou também que o 3-aminopirazol é energeticamente mais estável do que o 5-aminopirazol, com uma diferença energética de 10.7 kJ mol−1. Neste estudo foi também estudado o comportamento fotoquímico do composto tautomérico. Para tal, o composto isolado em matriz de árgon foi submetido a irradiação ultravioleta (UV) utilizando uma lâmpada de banda larga. O principal resultado observado foi a fototautomerização do composto mais estável 3AP para a forma 5AP, provavelmente por um mecanismo intramolecular. No âmbito deste programa de doutoramento foram também realizados trabalhos adicionais que, embora não examinados em detalhes nesta tese, resultaram em publicações científicas citadas e contribuíram para a formação científica da autora desta tese.
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Keywords
Tuberculose Fluoroquinolonas Análogos C-7 da delafloxacina Inibidores da girase Benzotiazinonas não-covalentes, Inibidores da DprE1, pirazolo[1,5-a]pirimidinas